محمد ياسين محمد تصميم وإستعمال الببتيدات المضادة للميكروبات لمكافحة جمهورية العراق وزارة التعليم العالي والبحث العلمي

Transcript

1 جمهورية العراق وزارة التعليم العالي والبحث العلمي جامعة بغداد معهد الهندسة الوراثية والتقنيات اإلحيائية للدراسات العليا تصميم وإستعمال الببتيدات المضادة للميكروبات لمكافحة المقاومة Acinetobacter baumannii بكتريا للمضادات الحيوية رسالة تقدم بها الطالب محمد ياسين محمد بكلوريوس علوم الكيمياء /كلية العلوم / الجامعة المستنصرية ))2000( والتقنيات الوراثية الهندسة معهد اإلحيائيه/ والتقنيات الوراثية الهندسة دبلوم فيي بغداد( 2013 ) جامعة العليا / للدراسات اإلحيائية إإل ىلى مجلس معهد الهندسة الوراثية والتقنيات اإلحيائية للدراسات العليا وهي جزء من متطلبات نيل شهادة الماجستير في الهندسة الوراثية والتقنيات اإلحيائية بإشراف الستاذ الدكتورة زهرة محمود الخفاجي 2016 م 1437 ه

2 )) س ن ر يه م آي ات ن ا ف ي ا ل ف اق و ف ي أ نف س ه م ح ت ى ي ت ب ي ن ل ه م أ ن ه ال ح ق أ و ل م ي ك ف ب ر ب ك أ ن ه ع ل ى ك ل ش ي ء ش ه يد (( صدق هللا العلي العظيم 53 سورة فصلت ا لية

3 اقرار المشرف على الرسالة أقر بأن إعداد هذه الرسالة جرى تحت إشرافي في جامعة بغداد/ معهد الهندسة الوراثية والتقنيات اإلحيائية للدراسات العليا وهي جزء من متطلبات نيل شهادة الماجستير في الهندسة الوراثية و التقنيات اإلحيائية التوقيع: المشرف :أد زهرة محمود الخفاجي المرتبة العلمية: أستاذ التاريخ: / / 2016 بناء على التوصيات ارشح الرسالة للمناقشة التوقيع: االسم: أ د أسماعيل عبد الرضا عبد الحسن المرتبة العلمية : أستاذ التاريخ: / / 2016 معاون العميد للشؤون العلمية

4 إقرار لجنة المناقشة نشهه نحن ههضحء لههة حلمنههشح ل نةلشههشحلح الرنههةح لههسح ل ههةلشح ل هه شح(( حتصممم وإسممتلما الببت مم ا المضمما للم كروبمما لمكافحممة بكتر مما Acinetobacter baumannii المقاوممة للمضما ا الح و مة (( لته حلهن ةح لاةله ( هنحاة هاضح ن )حف ح ر نح ل نن هشح ل اهشح ح لتنناهةاح ي اةةاهشحللن هةاح لرلاهة لهنحنةلشهنةح لاةله حفه ح ت اةت هةح حفا هةحلهةح هلهشحن هةح حننهن ح ن هةحمهنا حنهةلنن لناه حن مهشح ل ةم تا حف ح ل نن شح ل اشح ح لتنناشح ي اةةاش التوقيع: التوقيع: االسم: أ د رئيس اللجنة نادر إبراهيم محمد االسم: أ د عضو اللجنة ابو ريشة رسمية 2016 التاريخ: / / 2016 التاريخ: / / التوقيع: التوقيع: االسم: أ م مجيد إرشيد سباح زهرة محمود د االسم : أ الخفاجي اللجنة عضو عضو اللجنة )المشرف( 2016 التاريخ: / / 2016 التاريخ: / / مصادقة عمادة معهد الهندسة العليا على قرار اللجنة التقنيات و الوراثية اإلحيائية للدراسات التوقيع اسم العميد: أ د عبدالحسين الفيصل التاريخ: / / 2016

5 إلى اإلهداء مدينة علم هللا ومعلم البشرية النبي األكرم محمد صلى هللا عليه واله إلى روح أبي الذي لم يبخل علي يوما بشيء وإلى أمي التي غمرتني بالحنان والمحبة االعزاء إلى اخوتي وخواتي إلى زوجتي الحبيبةالتي كانت لي عوناوانيساوقت الضيق إلى إبنائي ثمرة فوادي إلى األصدقاء الوجه االخر غير البراق للحب, ولكنه الوجه الذي ال يصدأ أهدي لهم جهدي المتواضع حبا وإعتزازا محمد ياسين

6 شكر وتقدير بسم هللا الرمحن الرحمي الحم د هلل مالك الملك مجري الفلك مسخر الرياح فالق االصباح ديان الدين رب العالمين الحمد هلل على حلمه بعد علمه والحمد هلل على عفوه بعد قدرته والحمد هلل على طول اناته في غضبه وهو قادر على ما يريد والص اله والس الم على نبينا محمد وعلى آله وص حبه الطيبين الطاهرين فأ نه بعد ان م ن هللا تعالى علي بإكمال كتابة هذه الرسالة وجدت من اإلنصاف أن أتوجه بوافر الشكر واإلمتنان وعرفانا بالجميل الى الدكتورة زهرة محمود الخفاجي والتي تولت اإلشراف على هذه الرسالة فكانت كعادتها ح صنا لألمانة العلمية ومعلمة ت عطي بغير سؤال فكان لها الدور األهم واألبرز في ظهور هذه الرسالة بالشكل الذي هي عليه فجزاها هللا خير جزاء المحسنين ووفقها إلى طاعته ورضاه و أتقدم بالشكر والعرفان إلى اساتذة المعهد المحترمين الذين أسهموا بإرشاداتهم العلمية إلكمال دراستي وخاصة السيد عميد المعهد والسيد معاون العميد كما اتقدم بالشكر والتقدير الى جميع منتسبي المعهد فرع التقنيات االحيائية واخص بالذكر العاملين في أتقااابا كمااا لشاااوا تقليقاااب ا إلااا تجميااال ة ااااا قلب قاعااا ا قلن يااا قلااا ااا ق إ ااا ق تأ قا حق ل مس عبة قليي قبم ه لي فجزآهم هللا يا قلج قزء تفاي قلايا ا شاواو تتقاب او تعميا عافا ي لنا يي قلياي عااا بت ي تتقفا مناي ق اا تق لا الباحث

7 الخ الصة الزيادة في مقاومة بكتريا Acinetobacter baumannii وغيرها من االحياء المجهرية لمختلف, المضادات الحيوية في جميع أنحاء العالم البحث نحو دفعت عن مضادات جديدة ونظ ار لما تظهر الببتيدات المضادة للميكروبات الطبيعية (AMPs) Antimicrobial peptides من نشاط الطيف واسع ضد الميكروبات تطويرها على التركيز تم كعالجات بديلة جمعت 75 عينات ( جروح, عينة شملت بول, قشع, دم ) من المرضى ال ارقدين في مستشفى بغداد التعليمي / مدينة الطب مستشفى ابن بلدي و ومستشفى اليرموك التعليمي ) 2015/4/1, ومستشفى حماية الطفل )2014/11/4 للمدة الواقعة بين, وقد شخصت بإستعمال الصفات الزرعية )المستعم ارت( والمجهرية واإلختبا ارت الكيميائية الحيوية بإستخدام baumannii تم عزل 50 عزلة بكتيرية تعود لبكتريا Acinetobacter نظام, Api 20 E ( )% 6667 بنسبة ( البكتريا عزالت توزعت وقد في العينات المشخصة,جروح دم )12 % على التوالي, 12, 20,26,, حروق,اد ارر, قشع( هي )30, وقد 8 تم التحري عن حساسية عزالت بكتريا A baumannii تجاه مضادات من الحيوية % للمضاد Colistin أظهرت العزالت البكتيرية حساسية بنسبة 80 ومقاومة بنسبة, Cefotaxime, Piperacillin % للمضادات ( )66,78,84,86,90,92,94( Trimethoprim-, Tetracyclin, Meropenem, Amikacin, Ciprofloxacin على التوالي اذ اظهرت النتائج ان Colistin األكثر فعالية مقارنة ) sulfamethoxazole %30 بالمضادات األأخرى في عالج االصابة ببكتريا Abaumannii بينت الد ارسة ايضا ان Trimethoprim-, Tetracyclin من العزالت المقاومة للكولستين كانت حساسة لكل من ( )sulfamethoxazole, )MY1,MY2,MY3MY4( لها أ رمز الببتيدات من اربع تصميم تم الد ارسة هذه في أ صممت إذ قالب ضمن بإفت ارض المواصفات البيانات قواعد من العديد بإستخدم العامة للتنبؤ بالخصائص

8 الفيزيو كيمياوية, وت اروحت اطوال الببتيدات المصممة بين )11 الى 14( حامض أميني وبصافي ) +7 الى بين موجبة شحنة )6+ أ حددت فعالية الببتيدات المصممة بتطبيقها على عزالت بكتريا Abaumannii بطريقة قياس Mastoparan, وتم التركي ازلمثبط االدنى (MIC( المضاد الببتيد استخدم للميكروبات بمثابة A baumannii لفعاليته ضد سيطرة ومن ضمنها البكتريا انواع من العدد بكتريا بشكل عام اظهرت الببتيدات المصممة فعالية في الحد من نمو بكتريا, مقارنة ببتيد السيطرة إذ )69 24 ت اروحت معدالت قيم التركيز المثبط االدنى للببتيدات ( الى القيم بينما مايكروغ ارم, وتم AMPs 104 ( لببتيد Mastoparan الى 136( مايكروغ ارم تقييم سمية للخاليا, Hemolytic Activity (HC50) المضيفة بقياس فعالية انحالل الدم للببتيدات المصممة (560, 500, 440, 380( اظهرت النتائج قيم HC50 للببتيدات بمقدار مايكروغ ارم ) MY4,MY3,MY2, من لكل MY1) على التوالي وتبين بعد حساب مؤشر العالج Therapeutic Index خصوصية الببتيدات المضادة للمكروبات باستهداف خاليا بدائية النواة 7299, 7096, مقابل خاليا حقيقية النواة وكانت قيم )TI( للببتيدات بمقدار )12258 ) على التوالي (8615 لكل من MY1( MY4, MY3, MY2,,

9 المختصرات Abbreviations Abbreviations A baumanni AMPs CL CLSI Da ddh 2 O DNA HPLC ICU LPS LTA MDR MIC OmpA OMPs OXA PBPs PBS PG PH PS RPM T I TAs TSI Complete form Acinetobacter baumannii Antimicrobial peptides Cardiolipin Clinical and Laboratory Standards Institute Dalton Deionized Distilled water Deoxyribose nucleic acid High-pressure liquid chromatography Intensive care unit Lipopolysaccharide Lipoteichoic acid Multiple drug resistance Minimal inhibitory concentration Outer membrane protein A Outer membrane proteins Oxacillinases Penicillin binding proteins Phosphate buffer saline phosphatidylglycerol Power of hydrogen (H+) Phosphatidylserine Revolutions per minute Therapeutic Index Teichoic acids Triple sugar iron agar IX

10 قائمة المحتويات الخالصة باللغة العربية قائمة المحتويات قائمة األشكال قائمة الجداول قائمة المختصرات العنوان الفصل االول/ المقدمة الصفحة I IX X XI 1 المقدمة الفصل الثاني / استعراض المراجع جنس Acinetobacter النوع Acinetobacter baumannii عوامل ضراروة بكتريا Acinetobacter baumannii تكوين الغشاء الحيوي Biofilm formation عديد السكريد الشحمي Lipopolysaccharide Siderophore الحديد خالبات انتاج Adherence االلتصاق Capsule المحفظة Pathogenicity االمراضية مقاومة بكتريا A baumannii لمضادات الحياة خيارات العالج للحد من بكتريا Acinetobacter baumannii الببتيدات المضادة للميكروبات II

11 Antimicrobial peptides Mechanism of actions آلية عمل Toroidal pore model النمط االول Barrel-stave model النمط الثاني Carpet model النمط الثالث استهداف المحتويات الداخلية Resistance المقاومة الفصل الثالث / المواد وطرائق العمل المواد وطرائق العمل المواد األجهزة واألدوات المستعملة المواد الكيماوية والحيوية أقراص مضادات الحياة عمليات التعقيم التعقيم بالحرارة الرطبة )الموصدة( التعقيم بالحرارة الجافة الفرن الكهربائي Oven الحرق باللهب Incineration التعقيم بالترشيح االوساط الزرعية والتشخيصية االوساط الزرعية الجاهزة االوساط الزرعية التركيبية وسط اكار الدم االساس وسط أكار اليوريا االساس وسط اختبار االندول وسط لوريا السائل وسط المثيل االحمر- فوكس بروسكور III

12 وسط الحركة وسط ادامة العزالت البكتيرية وسط حفظ العزالت الكواشف المستعملة في االختبارات الكيموحيوية كاشف كوفاكس كاشف المثيل االحمر كاشف فوكس بروسكور كاشف انزيم االوكسيديز كاشف انزيم الكاتاليز كاشف اختزال النترات تحضير المحاليل المحلول الملحي الفسلجي محلول دارئ الفوسفات الملحي محلول ثابت العكرة القياسي طرائق العمل جمع العينات عزل بكتريا تشخيص العزالت التشخيص بالطرائق التقليدية االختبارات الكيموحيوية فحص حساسية بكتريا Abaumannii للمضادات الحيوية Disc diffusion method Microdilution method تصميم الببتيدات المضادة للبكتريا اعداد مكتبة صغيرة من الببتيدات المضادة للبكتريا افتراض قالب للببتيدات وقياس خصائصها حاسوبيا بناء الببتيدات Peptide synthesis قياس فعالية الببتيدات المضادة للميكروبات المصصمة IV

13 قياس فعالية تحلل الدم (HC50) Hemolytic Activity حساب مؤشر العالجية )TI( Therapeutic Index الفصل الرابع / النتائج والمناقشة النتائج والمناقشة تشخيص بكتريا Abaumannii التشخيص الزرعي التشخيص المجهري االختبارات الكيموحيوي التشخيص باستخدام نظام Api 20 E توزيع عزالت بكتيريا A baumannii حسب نوع العينات فحص حساسية بكتريا Abaumannii للمضادات الحياة تصميم الببتيدات المضادة للميكروبات الخصائص AMPs الفيزو كيميائية التحويرات AMPs المصممة فعالية الببتيدات المضادة للميكروبات فعالية انحالل الدم ( (HC50 Hemolytic Activity مؤشر العالجية (I T) االستنتاجات التوصيات المصادر المالحق الخالصة االنكليزية V

14 رقم الجدول قائمة الجداول الصفحة العنوان االجهزة والمعدات المواد الكيمياوية والحيوية أقراص مضادات الحياة االوساط الزرعية والتشخيصية نوع وعدد عينات البكترية التي جمعت أثناء الدراسة نتائج االختبارات الكيموحيوية لعزالت بكتريا Abaumannii توزيع العزالت لبكتريا Abaumannii حسب نوع العينات تواليات الببتيدات المضادة للميكروبات المصممة الخصائص الفيزيوكيمياوية للببتيدات المصممة في هذه الدراسة قيم التنبؤ بسمية AMPs و اختراقها للخاليا نشاط الببتيدات المصممة ضد بكتريا A baumannii المقاومة لمضاد Colistin نشاط الببتيدات المصممة ضد A baumannii الحساسة لمضاد Colistin نسبة المئوية تثبيط الببتيدات لنمو للعزلة رقم واحد VI

15 رقم الشكل قائمة األشكال العنوان نمط Toroidal pore model نمط Barrel-stave model نمط Carpet model النسب المئوية لخمسين عزلة من بكتريا A baumannii المقاومة Intermediat ومتوسطة الحساسية Sensitive والحساسة Resistant لمختلف المضادات الحيوية عالقة الشحنة بالطول للببتيدات المصممة تدرج قيم كراهية الماء للببتيدات المصممة و Mastoparan : صفة الكراهية للماء للببتيدات المصممة ( scale )Kyte-Doolittle عالقة الصفة التقابلية بالطول للببتيدات المصممة هيكل عجلة حلزونية Helical wheel للببتيدات المصممة الهيكل الثالثي االبعاد للببتيدات المصممة معدل قراءات الفعالية للببتيدات ضد العزالت المقاومة و الحساسة لمضاد Colistin تأثير تراكيز مختلقة من الببتيد MY1 للعزلة رقم واحد تأثير تراكيز مختلقة من الببتيد MY2 للعزلة رقم واحد تأثير تراكيز مختلقة من الببتيد MY3 للعزلة رقم واحد تأثير تراكيز مختلقة من الببتيد MY4 للعزلة رقم واحد تأثير تراكيز مختلقة من الببتيد Mastoparan للعزلة رقم واحد عالقة كراهية للماء بفعالية الببتيدات المضادة للميكربات عالقة الفعالية بمحتوى الببتيدات من الحامضين االرجنين )R( والتربتوفان ( )W شبكة الهيدروجين على سطح الببتيدات المصممة و Mastoparan فعالية انحالل الدم (HC50( Hemolytic Activity للببتيدات, MY1 MY2, MY2, MY3, MY4, Mastoparan الصفحة VII

16 العالقة بين كراهية الماء وفعالية حل الدم HC50( ) المؤشرات العالجية للببتيدات المصممة )I T( تباين النتائج ( )TI المختبرية والمتوقعة والعالقة مع طول الببتيدات المصممة تباين النتائج ( TI ) المختبرية والمتوقعة والعالقة مع الكراهية للماء الببتيدات المصممة تباين النتائج ( TI ) المختبرية والمتوقعة والعالقة مع الصفة التقابلية الببتيدات المصممة VIII

17 الفصل األول المقدمة

18 الفصل االول المقدمة -1 المقدمة Introduction 25 تعد بكتريا Acinetobacter من الج ارثيم الواسععععععععا افيتاعععععععا ال يعا ويوجد ما ف يقل عن و عدي منها مختلفا يوعا, النوع Acinetobacter baumannii من أكثر افيواع العائدة أهميا الجنس إلى A على الصعيد ال, و اثناء العقدين الماضيين ازدت األهميا السريريا لعزفت لما سعععععععععععععع ته من إصععععععععععععععابات ين الجنود افمريكان الجرحى أثناء الحرب على كل من الع ارق baumannii وأ غايستان ولقد تها العاليا على اكتساب مقاوما لجميع مضادات الحيويا المستخدما حاليا, وكذلك لقد تها Boulanger ( على ال قاء لمدة طويلا يئا المسععتاععفيات مما أدى الى سععرعا إيتاععا ها وتفاعع العدوى )et al, 2012 كما تعد بكتريا A baumannii مسععععععععلولا عن العديد من امصععععععععابات المكتسعععععععع ا المسععععععععتاععععععععفيات ), تجرثم الدم Meningitis ),السعععععععحايا ( Pneumonia ( منها ذات الرئا Nosocomial infections ),إلتهاب ال ريتون ( ), إصعععععععععععععععابات األيسععععععععععععععجا الر وة ( infections Soft-tissue Bacterimia (, إلتهاب شععععععععععععغا )Endocarditis( وإصععععععععععععابات المجرى ال ول ( tract Urinary القلب ) Peritonitis (Aoife et al, 2012 ( )infection بامتالكها العديد من عوامل الضعععععععععععع اروة الت تسععععععععععععاهم ام ارضععععععععععععيتها تمتاز بكتريا A baumannii ) Federico et al, 2015( المقا وما المت ازيدة لمضععععععععادات الحيويا تكثيف الجهود الى د ع التقليديا ال حثيا ميجاد مرك ات جديدة تعزز دو المضادات اف رى الحيويا الت يقات العالجيا وتكون أقل عرضا لت وير الميكروبات المقاوما تجععاههععا على عكس المضعععععععععععععععادات الحيويععا التقليععديععا, وواحععدة من تلععك المرك ععات ال تيععدات ه الواعععدة المضادة للميكروبات (AMPs) Antimicrobial Peptides يظ ار لخصائصها استهدا الكائنات الحيا, Amphipathicity الدقيقا الممرضعععا, عن ع ا ة وه تيدات صعععغيرة يسععع يا, بصعععفا تقا ليا متغيرة وتواليات ال ول افحماض افمينيا, والاععععععحنا والهيكل ان ث ت وقد هذة ال تيدات تمتلك الناععععععا ضععععععد طائفا واسعا من الكائنات الحيا الدقيقا, بما ذلك الفايروسات, ال كتيريا والف ريات, وتقتل أهدا ها بآليات عن طريق غال ا متعددة اض ارب الغااء الخلوي, إذ تستهد غااء الخليا وافساس افيتقائيا يعتمد 1

19 الفصل االول المقدمة Ziqing et al, 2014 على اف تال ات مكويات األغايا ين اليا دائيا النواة وحقيقيا النواة ( ) يكون ت و مقاوما السععععالفت الحسععععاسععععا لل تيدات المضععععادة للميكروبات أقل احتماف باععععكل ويعود AMPs أسعععععاس إلى عمق التغيي ارت الالزما نيا الغاعععععاء لمنق تلك المقاوما وتمثل المكويات الفعالا ) Zasloff, 2002( من الخط األول للد اع الن اتات والحاعععععععععععععع ارت والال قا يات والثدييات دأت و Zeya Spitznagel عام منذ األبحاث 1960 م عندما قام ال احثان و بأكتاف ال تيدات افساسيا ) اليا الدم ال يض )سميت يما بعد AMPs الت لها ياا ضد الج ارثيم,, Cationic معظمها تيدات موج ا الاععععععععحنا تكون غنيا باألحماض األمينيا اف جنين والاليسععععععععين ومع ذلك توجد ئا صعععغيرة منها سعععال ا الاعععحنا تصعععنف و ق معاير مختلفا كالحجم, افصعععل, Inionic ال نيا, تسلسل افحماض افمينيا, الخاليا المستهد ا و آليا العمل )2011 al, )Christine et الهدف من الد ارسة تصعععععععععععميم تيدات مضعععععععععععادة للميكروبات لها عاليا ضعععععععععععد بكتريا Acinetobacter baumannii المقاوما للمضادات الحيويا 2

20 الفصل الثاني استعراض المراجع

21 الفصل الثاني استعراض المراجع 1-2 جنس Acinetobacter إكتسب الجنس Acinetobacter اهمية كبيرة العقدين الماضيين اثناء وخصوصا التي اكتسب اهتماما هائال كواحدة من أهم انواع البكتيرية المسببة لالم ارض A baumannii )Joly-Guillou, 2005( و شكلت الهائلة على بسبب قدرتها ا كبير قلقا ا مصدر مقاومة مجموعة واسعة من المضادات Mobile genetic elements الحيوية واكتسابها العناصر الجينية المتحركة وقدرتها ) Doughari et al, 2011( على االستم ارر في طويلة جدا لمدة البيئة عزلت بكتريا Beijerinck من التربة عام 1911 من قبل العالم الهولندي الذي Acinetobacter ألول مرة أطلق عليها Dijkshoorn et al,2011; Peleg et ( Micrococcus calcoaceticus ( al, 2008 Coccobacilli غير مخمرة عصيات مكورة لصبغة سالبة انواع Acinetobacter غ ارم غير متحركة هوائية إجبارية غير منتجة لالوكسيديز بينما تنتج الكاتليز وغالبا ما توجد بشكل ثنائيات متغيرة 2008(, al )Giamarellou et سالسل أو Encapsulated تحاط العديد من سالالت Acinetobacter بمحفظة ( كبسولة ) و تكون مستعم ارت البكتريا عديمة الصبغة ومخاطية تمت د ارسة المحفظة بشكل مفصل كأحد عوامل الض اروة المهمة في ام ارضية البكتريا في العديد من الد ارسات المحلية )الخفاجي )2010 ; عبد الكريم ;2008 المشهداني ; مسافر 2007 ; المحنة ومعظم عزالت البكتريا لها قابلية النمو على األوساط الزرعية التي تحتوي على االمونيوم أو أمالح النت ارت كمصدر وحيد للنتروجين والخالت أو البايروفات أو الالكتات كمصدر وحيد ) تكون المستعم ارت Bergognge Berezin and Towner, 1996 للكربون ( النامية على وسط اغار الدم محدبة رصاصية فاتحة أو بيضاء اللون وسالالت النوع A haemolyticus حالة لكريات الدم الحمر بينما ال توجد هذه الفعالية في بقية أنواع هذا الجنس أما المستعم ارت النامية على وسط اغار الماكونكي ( Baron et al, 1994) فتكون مرتفعة ملساء صغيرة وتتدرج في لونها من مستعم ارت بلون وردي خفيف إلى عديمة اللون شاحبة ألنها غير مخمرة لسكر الالكتوز الموجود ضمن مكونات الوسط وهي بذلك تشبه أف ارد العائلة المعوية غير المخمرة لسكر الالكتوز وللتفريق بين المجموعتين يصار - 3 -

22 الفصل الثاني استعراض المراجع Triple sugar iron ( إلى تنمية كل منهما على وسط أغار الحديد ثالثي السكريات TSI البكتريا إذ إن ال تستطيع النمو في قعر الوسط كونها بكتريا هوائية مجبرة بينما )agar تتمكن أف ارد العائلة المعوية من ذلك )2004, al )Constantiniu et تعد بكتريا Acinetobacter من األجناس الواسعة االنتشار في الطبيعة حرة المعيشة أو رمية وتعزل بسهولة من التربة والمياه وفضالت المجاري وهي من األجناس المستعمرة لجلد األصحاء 2009(, al )King et و تعد من االجناس المهمة في حقل التقنيات الحيوية Biphenyl مثل Chlorinated biphenyl من الملوثات البيئية ا كبير عددا لتحطيمها و و والنفط الخام Acetonitrate وإ ازلة الفوسفات والمعادن الثقيلة كما تنتج العديد من lipases المركبات واالنزيمات أو داخلها مثل الخلية خارج وProteases فضال عن ) Abdel El- Haleem, 2003 ( انتاجها المستحلبات Bioemulsifiers Acinetobacter اقترح في عام 1954 ان تكون كجنس منفصل ولكن منذ لعائلة Neisseriaceae ذلك الحين مرت البكتريا بعدة م ارجعات الجنس نسب اذ شاملة Proteobacteria لكن في الوقت الحالي وضع هذا الجنس في مجموعة الرتبة للعائلة الثانية للبكتريا السالبة لصبغة غ ارم هي عائلة Pseudomonadales Psychrobacter و Moraxella مع جنسين آخرين هما Moraxellaceae )Gordon and Wareham 2010( 2-2 النوع Acinetobacter baumannii اكثر االنواع العائدة الى جنس Acinetobacter أهمية على الصعيد الطبي عزل النوع ألول مرة من التربة والمياه عام )1968( من قبل العالم Baumann وكذلك عزلت من عينات غذائية كاللحوم والخضر كما عزل من مختلف العينات المرضية لإلنسان كالدم والقشع A baumannii )Brooks et al,2007( والبول الجنبي والسائل تظهر بكتريا بشكل عصيات صغيرة مكورة Coccobacilli وهي سالبة لصبغة غ ارم هوائية غير متحركة ممرضة انتهازية تهاجم بصورة اساسية المرضى ال ارقدين في المستشفيات لها القدرة على إذ ( المقاومة والبقاء لمدة طويلة في جميع انحاء المستشفيات مما يعزز قدرتها االنتشار على يتمكن هذا النوع من البقاء مدة طويلة في الظروف الجافة ) Anton et al,2008 فمثال يبقى سبعة أيام على المالبس المغسولة الجافة وستة أيام على ورقة الترشيح الجافة - 4 -

23 م الفصل الثاني استعراض المراجع ولها وثالثة أيام على الفورميكا وسبعة أيام على الزجاج وأكثر من 25 يوما على القطن القابلية على النمو بح اررة 44 وهذا ما يميزها عن األنواع األخرى (, al Brooks et ) عوامل ض اروة بكتريا A baumannii -1 تكوين الغشاء الحيوي Biofilm formation 3-2 التصاق بعض انواع البكتريا على السطح يمكنها من التضاعف وتشكل مستعم ارت Exopolysaccharides ثم صغيرة انتاج سكريات متعددة خارجية عن ذلك وينتج تجمعات البكتريا من المت ارصة منتظمة بشكل كبير مع بعضها البعض أو مع غيرها من األنواع ويمنح Biofilm شائع باسم ضمن تركيب البكتيرية الغشاء الحيوي الغشاء الحيوي وهو العديد من الم ازيا للبكتريا داخل هذا التركيب بالمقارنة مع نظائرها التي تعيش بشكل حر بمثابة نظام فعال لتجميع ومحاصرة وتركيز المعادن والمواد المغذية االساسية من البيئة والبكتريا ضمن الغشاء الحيوي تصبح اكثر مقاومة لتأثير المضادات ودفاعات المضيف وبسبب القرب بين البكتريات الغشاء الحيوي داخل تتوفر )Dijkshoorn et al, 2007( )Donlan, 2002( بيئة مثالية لالنتقال االفقي للجينات المقاومة للمضادات واثبت الد ارسات وجود عالقة بين تشكيل الغشاء الحيوي والمقاومة للمضادات بين عزالت A baumannii من قبل A baumannii الغشاء الحيوي تكوين يعد كما )Rahbar et al, 2010( الية ام ارضية ويمنح تفسير مقاومتها المضادات الحياة والبقاء على قيد الحياة في بيئة المستشفى ويوفر للبكتريا الحماية من الضغوط الخارجية مثل الجفاف و قد تلجأ البكتريا Peleg ( مثل هذا A baumannii لتكوين الغشاء كإختيار تحت ضغط المضادات ) et al, عديد السكريد الشحمي ) (LPS Lipopolysaccharide تملك بكتريا Abaumannii في غشائها الخارجي LPS بمثابة مكون الذي يكون اساس وسم داخلي إليه وتعود أع ارض االصابة فضال عن في أهميته )Endotoxin ( التفريق والتشخيص بين االفرد العائدة لجنس Acinetobacter ويتكون LPS لبكتريا - 5 -

24 الفصل الثاني استعراض المراجع من و لب الكاربوهيد ارت والمستضد المتكرر وقد O-antigen Lipid A Abaumannii أثبات دور تم LPS في ام ارضية Abaumannii باستخدام الطف ارت ينتج عنها عزالت تفتقر الى Glycosyltransferase المشترك في تكوين LPS اقتطاعات عن مما اسفر Lipid A اذ كبيرة فيه يحتوي على اثنين فقط من الكاربوهيد ارت المرتبطة مع في وأثر انخفاض مقاومة البكتريا لمصل االنسان الطبيعي انخفاض بقائها وأيضا فأر االختبار في )Michael et al,2013( المصاب باالنسجة الرخوة بالمقارنة مع العزلة االبوية Siderophore الحديد خالبات انتاج للحديد دور أساس في العديد من العمليات الخلوية وله دور مهم كمغذي لجميع Ferritin اشكال الحياة تقريبا وغالبا ما يكون الحديد مرتبطا ببروتينات وTransferrin و Lactoferrin او على شكل معقد داخل حلقة الهيم مما يجعل مستويات الحديد في االنسجة (Skaar,2010 ومجرى الدم منخفضة جدا ( واحد اكثر االست ارتيجيات الشائعة التي تتبعها الكائنات الحية الدقيقة من اجل البقاء في ظروف محدودة للحديد انها تقوم بتخليق واف ارز مركبات ذات وزن جزيئي منخفض لها الفة عالية للحديد تسمى Siderophore الخالبات Crosa( تنافس المضيف باالرتباط بالحديد من أجل جعله متاحا للكائنات الحية الدقيقة ), االلتصاق Adherence قابلية الخاليا على االلتصاق على السطح هي بمثابة اول خطوة الستيطان مختلف البيئات لبكتريا A baumannii االلتصاق قابلية على سطوح غير حيوية مختلفة مثل ) الزجاج والبالستك al,2011( Antunes et طويلة ولمدة والتي تسهم في على بقائها االجهزة الطبية وكذلك للبكتريا A baumannii القدرة على استيطان بما الحية السطوح فيها جلد االنسان والسطوح المخاطية كما اكدت الد ارسات المختبرية ان البكتريا يمكن ان تلتصق بالخاليا الظهارية عوامل محددة وهناك مهما ا دور تؤدي في عملية االلتصاق Fimbriae مثل مكونات سطح الخلية او مثل الخمل الزوائد والمحفظة اضافة الى بروتينات ) Gaddy et al,2009( الغشاء الخارجي (OmpA) Outer membrane protein A - 6 -

25 الفصل الثاني استعراض المراجع ولكر اهية مهما ا دور الماء Hydrophobicity في عملية االلتصاق سواء على سطح المضيف للبكتريا A baumannii السطوح غير او إذ الحية من المعزولة المرضى ك ارهية عالية ) Gohl et al,2006 ( للماء مقارنة مع المعزولة من جلد االصحاء المحفظة Capsule تحاط خاليا بعض البكتريا بطبقة مخاطية تتكون من السكريات المكوثرة )Polysaccharides) التي تقع في البكتريا السالبة لصبغة غ ارم الى الخارج من الغشاء الخارجي وتسمى المحفظة, 2000 Alder )Boyce and او العلبة ( بكتريا A baumannii تعد المحفظة عامل من عوامل ام ارضية وهي تساهم في االفالت من دفاعات المضيف )2010 al, Russo et ( كما بينت د ارسة دورها في K locus ( K إم ارضية بكتريا A baumannii وذلك بإستعمال طف ارت في موقع الجينات إذ تحدد جينات ذلك الموقع انتاج السكريات المعقدة بما فيها المحفظة ونتيجة لذلك ) genes العزالت ظهرت التطفير التي تعاني من نقص في حساسية العلبة لمختلف المضادات الحيوية )Edward and Ralph,2015 دون التركيز المثبط االدنى )MIC) ( 4 االم ارضية Pathogenicity - 2 من الج ارثيم االنتهازية التي اثارت انتباه المختصين بسبب بكتريا A baumannii Multiple Drug قدرتها العالية على تطوير المقاومة ضد العديد من مضادات الحيوية ولها امكانية اكتساب المواد الو ارثية من اجناس مختلفة عن فضال Resistance (MDR) ) Federico et al, 2015( تشكيلها للغشاء الحيوي وقدرتها الكبيرة لاللتصاق باالسطح واالم ارض التي تسببها بكتريا A baumannii واسعة وفي مناطق مختلفة من جسم االنسان مع تفاوت شدتها بين المصابين من هذه اإلصابات : ذات الرئة والتهاب شغاف والسحايا القلب وإصابات الجروح والحروق والتهاب البريتون وتسبب التهاب العظام Lisa and ( والتهاب المفاصل Arthritis تجرثم الدم فصال عن Osteomylitis كما انها يمكن ان تستعمر الجلد والجهاز العصبي والعيون واصابة ) Trish,2008 االنسجة الرخوة وتشكل ا خطر ) Aoife et al, 2012) Soft tissue infections - 7 -

26 الفصل الثاني استعراض المراجع Intensive ا كبير على المرضى ال ارقدين في المستشفيات والسيما في اقسام العناية المركزة الذين المرضى إذ يعانون من ضعف بالمناعة طويلة في مدة ويقضون Care Unit (ICU) المستشفى هؤالء ويتعرض لالصابة بالبكتريا عن طريق معدات المستشفى عن طريق او موظفي الرعاية الصحية بمالمستهم للمريض المصاب بشكل مباشر وتلوث هذه البكتريا انحاء مختلفة من بيئة المستشفى وجدت على الستائر إذ وشف ارت فحص الحنجرة ومقابض االبواب والماسحات والمفاتيح ومعدات رفع المريض فضال عن المعدات الطبية وقد التشديد تم على ضرورة االهتمام بتطهير المعدات المشتركة وخصوصا معدات القسطرة والجهاز التنفسي ) Lisa and Trish,2008 ) مقاومة بكتريا A baumannii للمضادات الحيوية 5-2 إنتشرت البكتريا A baumannii المقاومة للمضادات الحيوية في جميع انحاء العالم : لقدرتها على البقاء في مختلف الظروف البيئية واكتسابها عوامل نتيجة جديدة و ارثية Mobile genetic elements اوال- العناصر الو ارثية المتحركة مثل البالزميدات القابلة لالننتقال Transferable االنتكرونات Integrons و الورثي للجينات التحوير ثانيا- وذلك الذاتية بالطف ارت التي تعمل على تغير في اهداف المضادات الذي بدورة يغير المقاومة الذاتية ومما يبعث على القلق وجود مثل تلك العناصر الجينية المتحركة اكتساب الجينات إذ بكتريا A baumannii يمكن ان يعمل ا تغير المقاومة في جذريا قابلية إلى ذلك اضف بمنح البالزميدات الحاملة لصفات مقاومة المضادات رجح نشرها مما اخرى من انوع بين المقاومة الذاتية البكتريا وتظهر البكتريا لمختلف المضادات نتيجة إنخفاض نفاذية الغشاء Ignasi et al,2012 ; Laura et ( الخارجي ومضخات الدفق Efflux pumps مقاومة البكتريا اصبحت وقد لجميع المضادات شائعة االستخدام تقريبا ومنها )al,2014 Polymyxins, Aminoglycosides, Quinolones, β-lactams Glycylcyclines و Tetracyclines, Chloramphenicol - 8 -

27 الفصل الثاني استعراض المراجع تشمل عدة :- مقاومة بكتريا A baumannii لمضادات β-lactam آليات إنزيمية آليات أو إنتاج األنزيمات المحللة اآللية الرئيسة في تمثل إذ للمضادات ( أ(- مقاومة مضادات وتكمن في إنتاجها أنزيمات β-lactamases واسعة وهي β-lactam الطيف التي لها يشفر بواسطة جينات محمولة على بالزميد او كروموسوم انزيم و من انزيمات الكروموسومية يعمل الذي على تحليل AmpC β-lactamases Thomson and ( Cefepime واسعة الطيف ماعدا Cephalosporins انزيمات وكذلك Oxacillinases (OXA التي تتميز بفعاليتها بتحليل ( )Bonomo,2005 مضادات اما انزيمات الحاوية على المعادن كل مضادات فتحلل Carbapenems عدا المضاد وهي غالبا ما تشفر لها بعناصر جينية Aztreonam β-lactams ) متحركة التي يمكنها االنتقال بسهولة بين البكتريا al,2005( Brown et آليات غير انزيمية وتشمل تغير نفاذية الغشاء اما بفقدان او انخفاض ( ب(- بروتينات الغشاء الخارجي (OMPs) Outer Membrane Proteins او زيادة مضخات مما الدفق يؤدي الى منع دخول المضاد او يعزز طرحه الى الخارج ( et Limansky Penicillin Binding فضال عن البروتينات توالي تفاوت ال اربطة للبنسلين ) al,2002 يحصل إذ تغيي ارت في مستويات التعبير عن انواع PBPs وقد الطبيعية Proteins (PBPs) اشارت الى الد ارسات وجود عدة اختالفات في نمط التعبير عن البروتينات ال اربطة بين بكتريا الحساسة والمقاومة لمضاد Carbapenem للمضاد األلفة إنخفاض وأن A baumannii مرتبطة مع الزيادة التعبير البروتينات al,2012) ) Ignasi et عن هذه تقاوم بكتريا A baumannii مضادات عن طريق حدوث تحوير في Quniolones موقع ارتباط المضاد اذ تحدث طف ارت في الجينات المشفرة إلنزيم DNA gyrase احد او انزيمات المستهدفة كما تمتلك البكتريا مضخات الدفق تعمل التي Topoisomerases بكتريا A ) Higgins et al,2004 دفق على المضاد خارج الخلية ( مقاومة أما لمضادات يكون بتغيير فيمكن ان مضخات الدفق Aminoglycosides baumannii او بالتعبير عن انزيمات التحوير وخصوصا إنزيمات Acetyltransferases و و ويشفر إلنتاج هذه األنزيمات Phosphotransferas Nucleotidyltransferase جينات أو بالزميداية كروموسومية أو تكون مقترنة مع االنتكرونات والجينات القافزة - 9 -

28 الفصل الثاني استعراض المراجع وتعمل تلك االنزيمات تحوير على مجموعة الهدروكسيل أو األمين الموجودة ضمن هذه ) Smith and Baker, 2002( المضادات للموقع المستهدف األلفة بذلك وتنخفض 16S rrna وتمتلك البكتريا الجين المسؤول عن مثيلة التي تمنح مقاومة كبيرة لمعظم مضادات Aminoglycosides مثل Tobramycin, Amikacin و Gentamicin Tetracycline آليات مقاومة ان في حين البكتريا لمضاد )Doi and Arakawa,2007( يتم بتحوير في موقع الهدف على الوحدة ال اريبوسومية )30S( لوجود جين محمول على بالزميد اقت ارني الذي يشفر لبروتين يوفر حماية للوحدة ال اريبوسومية من المضاد عن فضال )Ribera et al,2003( لجين يشفر إمتالكها ألنظمة الدفق لهذا المضاد Polymyxins اما آلية مقاومة البكتريا لمضادات فتتم بتقليل صافي الشحنة السالبة للغشاء الخارجي للبكتريا التقارب بين تقلل من وبذا المضاد وسطح البكتريا كما اشار Polymyxins مضادات عمل آلية ان اذ بتداخالت تكمن )2013( Velkov et al, الكهربائية المستقرة Electrostatic interactions بين الشحنات الموجبة لمجاميع جزيئات ومجاميع الفوسفات سالبة الشحنة Lipid A على في العديد السكري الشحمي Polymyxins ويمكن ان المقاومة تحدث نتيجة لتثبيط جينات معينة مسوؤلة عن التخليق (LPS) Lipid A للغشاء الحيوي مما يؤدي الى إدخال تعديالت مكونات على او اال ازلة بشكل كامال اشار وكذلك )2015( ان الى Qureshi et al, ) Moffatt et al,2010( Phospho-ethanolamine التعديالت lipid A على بإدخال كانت موجودة في Colistin جميع عزالت Abaumannii لمضاد المقاومة خيا ارت العالج للحد من بكتريا A baumannii 6-2 بكتريا A baumannii مستويات زيادة نتيجة في المقاومة ألغلب المضادات بما فيها الحيوية Colistin للعالج قليلة خيا ارت ترك الى ادى مع ذلك ال ت ازل أنواع من المضادات تستخدم لعالج العزالت الحساسة لها Carbapenem مثل مضادات وقد اكدت الد ارسات بأن Imipenem مضاد أكثر فعالية لعالج اإلصابة ببكتريا مقارنة مع al,2006( )Jones et بالنسبة اما Meropenem مضاد A baumannii مضادات Aminoglycosides فان الخيا ارت العالجية هي Tobramycin و

29 الفصل الثاني استعراض المراجع اما في حالة مضادات Tetracycline تستخدم ) Lisa and Trish,2008( Amikacin Doxycycline كل منMinocycline و في عالج االصابة ببكتريا A baumannii مثبطات أنزيمات β-lactamase inhibitors )Bishburg and Bishburg,2009( A baumannii قد تكون احد خيا ارت العالج وخصوصا لنشاطها ضد العديد من عزالت Peleg et ( ظهور عزالت قبل وذلك بمستوى عالي من المقاومة ضد نوع من هذا المثبطات β-lactamase فقد وثقت النتائج السريرية فعالية مثبطات أنزيمات مجتمعة ) al,2008 مع مضاد االمبسلين )المتوفر تجارية( في عالج االصابات الخفيفة والشديدة ببكتريا )Urban et al,1993( Abaumannii اما فيما يخص العالج بمضاد Tigecycline فقد اكدت العديد من الد ارسات A baumannii استجابة مقبولة لعالج مرض االلتهاب بكتريا تسببه الذي الرئوي مع ذلك لكن يوجد قلق حول امكانية تحقيق تركيز مالئم في ) Shin et al,2012) )2014( Yu-Chung et al, مصل المريض اذ اشار الى زيادة عدد الوفيات قد تكون له صلة بتركيز Tigecycline لذلك يجب توخي الحذر عند اختيار هذا المضاد للعالج وعلى رغم من ظهور سالالت مقاومة Colistin لمضاد الذي يعد االختيار االول ضد البكتريا إال ان معدل منخفضا بقى المقاومة المضاد واظهر نشاط على نسبة كبيرة من قاتل وهو النواع بكتريا ) السالالت في المختبر Pachon,2012( Vila and Acinetobacter وتأثيره يعتمد على التركيز اضط ارب على المضاد ويعمل الغشاء وبتالي ) Li et al,2006 ( زيادة النفاذية مؤديا الى موت الخاليا البكتيرية وربما يكون من المستحسن استخدام الجمع بين المضادات في العالج لمنع ظهور العزالت المقاومة للكولستين Colistin أن يستخدم يمكن إذ بشكل مزيج مع مضادات اخرى يكون لها تأثير تأزري في عالج بكتريا A baumannii المقاومة للعديد من المضادات الحيوية كما اشار Wareham الى حصول تأزر بين مضاد ومضاد Teicoplanin في Colistin )2011( et al, Cephalospor, عالج A baumannii مجاميع لثالث المقاومة من المضادات و الجمع بين وكذلك وRifampin Colistin او Aminoglycosides Quinolones لمعالجة وامنة فعالة عالجات تعد التي التي تسببها االلتهابات Meropenem و Colistin ) البكتريا المقاومة للعديد من المضادات )2011 al, Liang et

30 الفصل الثاني استعراض المراجع 7-2 الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) Antimicrobial peptides الكائنات الحية التي تعيش بصورة مستمرة في البيئة معقدة وتتعرض فيها للعديد من مسببات االم ارض التي ينجم عنها ا ضرر ا كبير في خاليا المضيف وفي حالة االصابة يجب ان تكون مناعة المضيف قادرة على التميز والقضاء على الغزو الجرثومي بكفاءة عالية قبل ان ي حفز نظام المناعة المكتسبة وفي العديد من الحاالت يكون من ضروري القضاء على مسببات االم ارض دون الحاجة لتحفيز آلية االلتهابات والمناعة المكتسبة ومنع االستجابة المناعية لخاليا المضيف بصورة كاملة ولتحقيق ذلك عبرت المناعة الفطرية عن الببتيدات المضادة للميكروبات ) AMPs Antimicrobial peptides ( وهي جزئيات حيوية فعالة يتم انتاجها من قبل مجموعة واسعة من الكائنات الحية وقد وجد انها تنتج في كل من حقيقية النواة وبدائية النواة في الكائنات الحية ال ارقية رئيسا ا دور تؤدي في المناعة الفطرية كجزء من الخط الدفاعي االول ضد مسببات االم ارض مهما و لها ا دور في مكافحة معظم االصابات ) قبل ظهور االع ارض ( 2010 al, Peters et وبشكل عام AMPs قصيرة الطول فأن منخفضة الوزن الجزيئي وبصفة تقابلية تحتوي على العديد من االحماض االمينية كارهة للماء موجبة الشحنة (, Brogden واشارت العديد من الد ارسات الى وجود سالبة ببتيدات )2005 ; Oren and Shai, 1998 الشحنة وهي قليلة مقارنة بالموجبة الببتيدات وتعد بمثابة عالجات واعدة بسبب نشاطها الواسع وسميتها القليلة لخاليا المضيف وانخفاض تطور المقاومة من قبل الخاليا المستهدفة ) يعود اكتشاف Hancock and ضدها Patrzykat,2002( الى عام هذه الببتيدات عندما استخلص مضاد من ساللة بكتريا Bacillus لعالج الفئ ارن Dubose 1939 ) Dubos,1939( المصابة ببكتريا Streptococcus pneumoniae الببتيدات نشاط ويعتمد االحيوي بشكل عام على البنية الهيكلية ومجموعة من الصفات الفيزيوكيمياوية 2004( Yeaman, (Yount and اظهرت الببتيدات وقد واسعا نشاطا الطيف ضد العديد من انواع بكتريا السالبة والموجبة صبغة غ ارم والفطريات والفيروسات وكذلك الطفيليات Gallo,2007( )Radek and ولها أدوار متعددة في الجهاز المناعي وعوامل االستجابة مثل الخاليا اصابة عند المناعية االنجذاب الكيميائي وتحرير السايتوكينات

31 الفصل الثاني استعراض المراجع ( Koczulla and Bals, 2003( وتكاثر الخاليا فضال عن إصالح االنسجة وشفاء الجروح ويمكن ان تكون مضادة للسرطان كما ) Hoskin and Ramamoorthy, 2008( من المحتمل ان تكون لها فوائد في الزر اعة وتربية االحياء المائية )2000 al, )Jia et العمل آلية Mechanism of actions والجدارن العلب الخارجية هي للبكتريا حواجز كبيرة ضد كل المضادات او الحيوية اي مواد اخرى قد تسبب ضرر للخلية وكبيقية المضادات على الببتيدات المضادة ان للميكروبات تجتاز تلك الجواجز باستهداف سواء فعالة لتصبح الغشاء مباشرة او العبور الى داخل الخلية للوصول الى المكونات التي تعمل عليها األكثر والنمط نمط شيوعا هو استهداف األغشية إذ أشارت معظم الد ارسات الى هي بالببتيدات القتل است ارتيجية ان )Boniotto et al, 2003( االخالل بأغشية االحياء المجهرية المستهدفة لتداخل كهربائي ( Brogden, ويكون أول تالمس بين البكتريا والببتيدات نتيجة بسبب قوة تجاذب الشحن المتعاكسة الببتيدات بين موجبة الشحنة وسطح الخلية )2005 Lipoteichoic Teichoic acids (TAs) البكترية السالبة الشحنة لوجود حامض وحامض في جدار البكتريا موجبة صبغة الغ ارم و السالبة صبغة البكتريا لجدار LPS acid (LTA) غ ارم والتداخل الكهربائي يحدث بغض النظر فيما إذا الببتيدات تستهدف غشاء الخلية فقط او بنفاذها الى داخل الخلية الستهد فا المكوناته الداخلية او النمطين معا ان عملية ارتباط الببتيدات بغشاء الخلية يسبب اضط ارب في الغشاء الخارجي واصطفاف Self- مكونات طبقة الدهون الثنائية المفسفرة بطريقة تسمى تعزيز اإلمتصاص الذاتي والببتيدات المرتبطة تنتشر على الغشاء مما يسمح بانقالبها الى promoted uptake وتصطف طوال مع مكونات الدهون المتجاورة مؤدية الى اخالل طفيف يؤثر في الداخل الغشاء سالمة من ناحية اخرى في تؤثر الببتيدات فأن االحياء المجهرية بتكوين ثقوب تكوين أو األغشية في قنوات تسمح لها باقحام نفسها في طبقة الدهون الثتائية تتداخل وبالتالي مع الغشاء قبل تكوين 2003(, Yount )Yeaman and الثقوب والتداخل مع األغشية على يعتمد الك ارهية للماء التي تملكها تلك الببتيدات لصفة التقابلية وكذلك في مهما ا دور نشاطها اذ تعتمد في التداخل مع االغشية على وجود جزء كاره للماء يقابلة وجود جزء

32 الفصل الثاني استعراض المراجع محب للماء al,2000( )Tossi et الجانب المحب للماء والمشحون الجزء مع يتحد المشحون في الدهون مكونا للماء الكارهة الجزء اما الثقوب فيصطف مع مكونات الدهون حلزون ألفا ولبنية للماء الكارهة دو ار في تسهيل التغلغل في الغشاء لكل لوحظ ان كما Oren and ( الببتيدات تركيب بنائي التقابلية الصفة نمط فيها تظهر و بيتا ألفا نوع من -: انماط ثالث وهناك هي االكثر قبوال لوصف آلية إستهداف األغشية )Shai, 1998 : الول النمط Toroidal pore model الغشاء الى الببتيدات ترتبط وفيه يليه تجمع المزيد من وحدات الببتيد وهذه الفعالية تؤدي الى تدهور مكونات الدهون االفقية مسببة اضعاف التركيب الداخلي وبالتالي المتكونة الثقوب كل الثقوب تكوين تكون مبطنة بعدد من وحدات الببتيد المرتبطة بأحكام مع المجاميع ال أرسية للدهون مكونة بذلك ا جدار عملية تكوين اثناء بشكل موضح كما الثقوب ويحدث موت الخلية نتيجة خروج محتويات السايتوبالزم إلى المحيط الخارجي )1-2 ( ) Hale and Hancock, 2007 (

33 الفصل الثاني استعراض المراجع الشكل :)2-1( النمط االول ( model )Brogden, 2005( )Toroidal pore : الثاني النمط Barrel-stave model يؤدي الى تكوين فكالهم االول نمط يشبه في الغشاء نتيجة ثقوب إصطفاف وحدات الببتيدات ولكن مع وجود في اختالفات الخطوات الوسطية أن وحدات الببتيد في البدء ترتبط بالغشاء وتدرج نفسها في هيئة موازية لمكونات الدهون في الغشاء االد ارج اما ان يحدث بأقحام وحدة ببيتيد واحدة في الغشاء تليها التحام جانبي بقية الوحدات او باقحام عدد من وحدات الببتيد دفعة واحدة ويكون الجزء الكاره للماء من وحدات الببتيد الى الخارج والجزء المحب للماء الى وبذلك يتكون الداخل بالتعاون ثقب مع لب الدهون في الطبقة ثنائية ) موضح كما الدهون شكل )2-2 تسرب تسبب المتكونة الثقوب لمحتويات الداخلية مؤدية الى موت الخاليا 2001( al, )Yang et

34 الفصل الثاني استعراض المراجع الشكل ( :)2-2 النمط الثاني ( model )Brogden, 2005( (Barrel-stave : الثالث النمط Carpet model 2 يختلف هذا في غشاء تكوين ثقوب السابقين بعدم النمطين عن اآللية أو النمط الخلية وبدال من ذلك تبقى الببتيدات مرتبطة على سطح الخلية وعندما تتجمع وحدات الببتيد على السطح بكمية كافية تؤدي الى إضط ارب في الكهربائي للغشاء الجهد وتحث الببتيدات اضعاف موضعي في الغشاء مؤدي الى تحطم الغشاء مكونة ت اركيب تشبه السجاد وبالتالي )Hale and Hancock, 2007( تتسرب محتويات الخلية 2-3( كما موضح شكل)

35 الفصل الثاني استعراض المراجع الشكل )2-3( : نمط الثالث ( model )Brogden, 2005( )Carpet استهداف المحتويات الداخلية : توجد عدة انواع من الببتيدات تستهدف المكونات داخل الخلية وقد تستهدف عدة مواقع في الخلية نفسها او تستهداف الغشاء والمكونات الداخلية بطريقة تعاونية لضمان قتل ) سريع وفعال 2011( al, Nguyen et تشير الد ارسات الببتيدات أن إلى يجب ان تستخدم بت اركيز عالية بما فية الكفاية Cudic and ( لتكوين ثقوب لقتل االحياء المجهرية عن طريق االض ارر باالغشية بعضها يمكن ان تقتل البكتريا دون ان تؤثر في سالمة الغشاء اذ تنفذ الى )Otvos,2002 داخل الخلية وتثبط مسا ارت مهمة مثل مسا ارت تضاعف DNA وتخليق البروتينات Proteases والبعض االخر تثبط االنزيمات المحللة للبروتينات ) Brogden,2005(

36 الفصل الثاني استعراض المراجع ) في االحياء المجهرية ( 1991 al, Nishikata et من بين هو داخل الخلية الفعاليات DNA polymerase استهداف اكثر من مكون فبعضها لها القدرة على تثبيط انزيم الكوثرة RNA او يمكنها أيقاف تخليق بشكل كامل عند تركيز اقل تحتاجه الذي التركيز من المضادات أظهر عددا كما العمل بهذا للقيام االخرى الحيوية في عملية هاما دو ار منها تشكيل الحواجز أثناء انقسام الخلية البكتيرية ( 1992, Farias )Salomon and المقاومة Resistance AMPs سبق االفت ارض أنه من الصعب للميكروبات المقاومة ضد تطوير واالعتقاد السائد أن اآللية الرئيسة للببتيدات هي التداخل مع االغشية لذا فمن الصعب للغاية بالنسبة للميكروبات المواجهة بسبب التعديالت الكبيرة الالزمة على الغشاء فأن ذلك فضال عن التغيي ارت في مختلف عبرت التي الببتيدات عنها الخاليا المضيفة يجعل من الصعب على الكائنات الحية الدقيقة أن تطور آليات المقاومة ضد مجموعة متنوعة م وجودة في الوقت ذاته لكن في الوقت الحاضر تبين أن الكائنات الحية الدقيقة قادرة على تطور المقاومة حد الى أكبر وبطريقة أكثر تنوعا مما كان يعتقد سابقا فهذه المقاومة يمكن أن تكون نتيجة آلليات مختلفة والتي يمكن أن تنطوي على زيادة مستويات االنزيمات المحللة للبروتينات والتعديالت )Pasupuleti et al, 2012; Nizet الغشاء على )2006, Phospholipids بنية اختالف ان الدهون المفسفرة تتبعه اسلوب هو األغشية في الميكروبات لحماية نفسها من غزو الببتيدات فقد تفتقر الكائنات الحية الدقيقة بطبيعتها التكوينية للكهربائية الالزمة الببتيدات مع للتداخل ومثال على الكائنات الحية الدقيقة التي تملك هذا النوع من آاللية هو بكتريا Staphylococcus aureus اذ ثبت امتالكها نوعا مختلفا من بنية الغشاء عن األنواع االخرى من البكتريا Staphylococcus والتغيير ات في ) لمقاوتها) al, 1984 Nahaie et بمثابة تكون الغشاء مكونات مفتاح المقاومة الرئيس ويمكن للكائنات الحية الدقيقة أيضا أن تحمي نفسها ايضا بتطوير المقاومة المتخصصة وفي هذا النوع تستغل منافذ تشريحية أو فسيولوجية معينة ويمكن لهذه المنافذ Osmotic Pressure على سبيل المثال تتعلق بمحيطها التي زيادة الضغط مثل التنافذي بزيادة تركيز الملح والبكتريا Pseudomonas aeruginosa من الكائنات الحية الدقيقة

37 الفصل الثاني استعراض المراجع استخدمت التي هذا النوع من اآللية خاصة بيئة تولد اذ في األنسجة المصابة بتركيز ملح غير طبيعي عدد من ألن وذلك الببتيدات تكون حساسة في كثير من األحيان إلى مستويات مرتفعة من الملح واالحياء المجهرية يمكن أن تتجنب الببتيدات باستغالل هذا النوع في ) البيئة ( Yeaman,2004 Yount and ارتباط الشحنة هي الببتيدات لنشاط الرئيسة اآلليات ومن الذي الغشاء مع لها الموجبة غالبا سالب يكون البكتريا في الشحنة فبعض أنواع البكتيريا لديها القدرة على الصمود أمام ) Pasupuleti et al, 2012( التداخل هذا عن طريق تغيير خصائص شحنتها ان البكتريا موجبة صبغة مثل غ ارم البكتيريا Staphylococcus aureus للغشاء تفتقر Teichoic acid وتعوض ذلك الخارجي جزئيات بتكثف من حامض يشكل الجزء الذي الخارجي من البكتريا والتغير الطبيعي يمكن ان يحدث عن طريق ادماج الحامض االميني يؤدي إلى الذي الشحنة السالبة من التقليل لجدار الخلية وهذا التخفيض D-alanine Peschel, ( الببتيدات طرد يؤدي إلى بالشحنة قبل أن تتمكن من الوصول إلى هدفها )2002 أيضا اما البكتريا سالبة صبغة فتستخدم مبدا غ ارم مماثال اذ ان حالة الغشاء الخارجي Lipid A الوصول في يؤثر الببتيدات إلى هدفها ويمكن ان يحصل تعديل في في جزيئة ليقلل من بشكل عام السالبة الشحنة األمر الذي يؤدي إلى انخفاض مع التداخل LPS الببتيدات )Gunn,2001( فضال عن األخرى آليات تستخدمها بعض الكائنات الحية الدقيقة لمواجهة قبل الببتيدات سطح الخلية الى الوصول تتحقق يمكن أن الذي بطرق مختلفة واحد هي الخيا ارت هذه االنزيمات المحللة التي يمكن أن تنتجها الكائنات الحية الدقيقة التي بدورها تكون على قادرة ) Nizet, 2006( الببتيدات تحطيم المضادة للميكروبات قبل أن تصل إلى هدفها

38 الثالث الفصل المواد وطرائق العمل

39 الفصل الثالث المواد وطرق العمل 3- المواد وط ارئق العمل 1-3 المواد األجهزة واألدوات المستعملة االجهزة والمعدات المستعملة في الد ارسة جدول )1-3( جدول )1-3(: االجهزة والمعدات ت اسم الجهاز الشركة المصنعة المنشأ اطباق بتري Al-Hani company لبنان 1 Disposable Petri dishes Super star انابيب اختبار Test tubes الهند 2 Concord Refrigerator ثالجة )ب ارد( لبنان 3 GFL جهاز التقطير Distillator المانيا 4 Fanem جهاز النبذ المركزي Centrifuge الب ارزيل 5 Selecta Incubator حاضنة اسبانيا 6 جهاز قارئ امتصاصية الصفائح الدقيقة اميركا BioTek 7 Absorbance microplate reader GFL Water bath حمام مائي المانيا 8 Bionex Vortex خالط منضدي كوريا 9 ش ارج )عروة( ناقل Loop انتاج محلي الع ارق 10 ش ارئح زجاجية Super star الهند Slides 11 عدة تشخيص فرنسا Biomeriux Api20E 12 فرن كهربائي Gallen Khamp انكلت ار Oven 13 كابينة زرع Gallen Khamp انكلت ار Hood 14 كامي ار رقمية اليابان Nikon Digital camera 15 ماصات دقيقة بإحجام مختلفة Micropipettes كندا Biostatic 16 مجهر ضوئي اليابان Olympus Microscope

40 الفصل الثالث المواد وطرق العمل Sartorius 045 μm مرشحات دقيقة المانيا 18 Filter membrane Amal Burner مشعل غازي تركيا 19 Orient مقياس الرقم الهيدروجيني ph meter اميركا 20 Selecta Autoclave م ؤصدة اسبانيا 21 Jiangsu مطياف ضوئي Spectrophotometer الصين 22 Sartorius مي ازن حساس Sensitive balance المانيا 23 Al-Hani company لبنان Microtiter plate المواد الكيماوية والحيوية استخدمت في هذه الد ارسة كل من المواد الكيميائية والحيوية اآلتية : جدول )2-3(: المواد الكيمياوية والحيوية ت اسم المادة الشركة المصنعة المنشأ BDH بريطانيا α - Naphthol (C 10 H 8 O) 1 Merk انكلت ار Absolute Ethanol 99% 2 BDH انكلترا Bromophenol blue 3 Merk انكلت ار Ethanol 75% 4 BDH بريطانيا Glycerol 5 SYR Bio سويسرا Gram staining set 6 BDH انكلترا Methyl red 7 Hi-media الهند NNNN- Tetra-methyl P-Phenylene- 8 Diamine Dihydro Chloride Fluka سويس ار Para-dimethylaminobenzaldehyde 9 BDH بريطانيا Pepton

41 الفصل الثالث المواد وطرق العمل BDH انكلترا Phenol red 11 BDH بريطانيا Sulphanillic acid 12 BDH بريطانيا Trypto 13 Mast Diagnostic اميركا Urea supplement 14 Fluka سويس ار Yeast extract 15 BDH بريطانيا α - Naphthylamine 16 بيروكسيد الهيدروجين BDH بريطانيا (H 2 O 2 ) 3% 17 حامض الكبريتيك المركز BDH بريطانيا H 2 SO 4 18 حامض الهيدروكلوريك المركز BDH بريطانيا HCl 19 دم بشري مستشفى المثنى الع ارق Human blood 20 العسكري فوسفات الصوديوم احادي الهيدروجين BDH بريطانيا 21 Na 2 HPO 4 فوسفات الصوديوم ثنائية الهيدروجين BDH بريطانيا 22 NaH 2 PO 4 كلوريد الباريوم BDH بريطانيا Bacl 2 H 2 O 23 كلوريد الصوديوم BDH بريطانيا NaCl 24 كلوكوز BDH بريطانيا Glucose 25 ماء مقطر خالي من االيونات Bioneer كوريا 25 )Deionized distilled water (ddh2o هيدروكسيد البوتاسيوم BDH بريطانيا KOH 27 هيدروكسيد الصوديوم BDH بريطانيا NaOH

42 الفصل الثالث المواد وطرق العمل أق ارص مضادات Antibiotic discs الحيوية أق ارص مضادات الحيوية جدول )3-3(: ت المضاد الحيوي رمز المضاد تركيز المضاد )مايكرغ ارم/قرص( 100µg PRL Piperacicllin 1 30 µg CTX Cefotaxime 2 10 µg MEM Meropenem 3 30 µg AK Amikacin 4 30 µg TE Tetracyclin 5 10 µg TMP Trimethoprim-sulfamethoxazol 6 5 µg CIP Ciprofloxacin عمليات التعقيم التعقيم بالح اررة الرطبة )الموصدة( 15 عقمت األوساط الزرعية وبعض المحاليل بجهاز الموصدة 121 بدرجة ح اررة لمدة م دقيقة و تحت ضغط 102 جو) )atm التعقيم بالح اررة الجافة الفرن الكهربائي Oven 180 ع قمت الزجاجيات المستعملة الزرعية والمحاليل بالفرن الكهربائي تحت درجة ح اررة م مدة ساعتين الحرق باللهب Incineration

43 الفصل الثالث المواد وطرق العمل عقم Loop وابرة التلقيح والملقط وغيرها بتعريضها مباشرة للهب التعقيم بالترشيح استعملت في هذه الطريقة مرشحات غشائية ذوات قطر 045 و مايكرومتر 022 لتعقيم المحاليل التي تتأثر بالح اررة العالية االوساط الزرعية والتشخيصية االوساط الزرعية الجاهزة حضرت االوساط الزرعية الجاهزة والموضحة في جدول )4-3( وفق تعليمات الشركة المصنعة لها والمثبتة على العبوة الخاصة بكل وسط جدول )4-3(: االوساط الزرعية والتشخيصية ت اسم الوسط الشركة المصنعة المنشأ الهند Himedia Simmon citrate agar 1 انكلت ار Oxoid Blood agar base 2 انكلت ار Oxoid Gelatine medium 3 انكلت ار Oxoid MacConkey agar 4 انكلت ار Oxoid Mueller-Hinton 5 انكلت ار Oxoid Nitrate broth 6 انكلت ار Oxoid Nutrient agar 7 انكلت ار Oxoid Nutrient broth 8 انكلت ار Oxoid Triple sugar iron agar 9 انكلت ار Oxoid Urea agar base

44 الفصل الثالث المواد وطرق العمل االوساط الزرعية التركيبية وسط اكار الدم االساس Blood agar base حضر وسط أكار الدم األساس وفق تعليمات الشركة وعقم بالموصدة ثم برد إلى درجة ح اررة م وبعدها أضيف إليه الدم بنسبة بشري %8 ومزج بلطف ثم صب في اإلطباق, وترك 50 ليتصلب )Cheesbrough,2012( 2 وسط أكار اليوريا االساس Urea agar base حضر الوسط بإذابة غ ارم من أكار اليوريا في 950 ملتر من المااء المقطار ثام عادل 24 الرقم الهيدروجيني إلى وعقم بالموصدة ثم ترك ليبرد إلى درجة ح اررة م ثم أضيف ملتاااار ماااان محلااااول Urea المعقاااام باسااااتعمال مرشااااحات دقيقااااة Supplement %40 50 بقطر 045 مايكرومتر, ثم صب بواقع مللتر لكل أنبوب وترك ليتصلب بشكل مائل وحفا 15 في درجة ح اررة م اساتعمل هاذا الوساط للتحاري عان قابلياة العازالت علاى إنتااج إنازيم الياوريز 4 )Cheesbrough,2012( وسط اختبار االندول Indol test 950 حضر الوسط بإذابة 20 غ ارم من التربتون و 5 غ ارم من كلوريد الصوديوم في 1000 ملتر, مللتر من الماء المقطر, ثم عدل الرقم الهيدروجيني إلى 72 وأكمل الحجم إلى ثم صب في أنابيب بواقع مللتر لكل أنبوب, وعقم بالموصدة, وحف في درجة ح اررة 5 م, استعمل الوسط الختبار قابلية العزالت على استهالك التربتوفان وانتاجها النزيم 4 الذي يحلل التربتوفان الى مكوناته االيضية ونتيجة ذلك تتشكل االندول حلقة Tryptophanase )Collee et al,1996(

45 الفصل الثالث المواد وطرق العمل وسط لوريا السائل حضر الوسط بإذابة غ ارم من التربتون و 5 غ ارم من مستخلص الخميرة و 5 غ ارم من 10 كلوريد الصوديوم في ملتر من الماء المقطر ثم عدل الرقم الهيدروجيني إلى 7 وأكمل 950 Monthon and ( الحجم إلى 1000 مللتر ثم عقم بالموصدة استعمل الوسط إلدامة العزالت )Songtham,2008 Voges-Proskauer وسط Methyl Red حضر الوسط بإذابة 7 غ ارم من الببتون و 5 غ ارم من الكلوكوز و 5 غ ارم من فوسفات البوتاسيوم أحادية الهيدروجين في 950 مللتر من الماء المقطر ثم عدل الرقم K 2 HPO 4 الهيدروجيني إلى وأكمل الحجم إلى مللتر ثم صب بواقع مللتر لكل أنبوب وعقم ) Brown,2005( 4 بالموصدة وحف بعدها في درجة ح اررة م الحركة اختبار وسط حضر بإذابة 10 غ ارم من تربتون و 5 غ ارم من كلوريد الصوديوم و 5 Agar في غ ارم كمية من الماء المقطر ثم أكمل الحجم إلى لتر من الماء المقطر, بعد ضبط األس 1 الهيدروجيني عند 72 ثم عقم في الموصدة )Hargrave,2000( وسط ادامة العزالت البكتيرية لقحت األنابيب الحاوية على وسط االكار المغذي المائل بالعزالت البكترية وتم حضنها بدرجة ح اررة م لمدة ساعة, بعدها حفظت في درجة ح اررة م لحين االستخدام, وتمت عملية إدامة العزالت بشكل دوري شهريا وذلك بتنشيطها على الوسط المغذي السائل وعلى وسط لوريا السائل, ثم إعادة زرعها على وسط مائل جديد لضمان بقاء العزالت بشكل نشط حتى اكتمال مدة الد ارسة )2003 )WHO,

46 الفصل الثالث المواد وطرق العمل وسط حفظ العزالت ح ضر وسط السائل المغذي ووزع في قناني صغيرة وعقم بالموصدة ثم ترك ليبرد في درجة ح اررة الغرفة, ثم لقح بمستعم ارت نقية من البكتريا النامية على وسط االكار المغذي بالش ارج الناقل, وحضنت القناني لمدة 24 ساعة في درجة ح اررة م, بعدها تم إضافة ملتر من º20- الكليسرول لكل 85 مللتر وسط المغذي السائل, وحفظت القناني في درجة ح اررة م استعملت هذه الطريقة في الحف طويلة لمدة 6 الكواشف المستعملة في االختبا ارت الكيموحيوية كاشف كوفاكس Kovac`s reagent Para-dimethylaminobenzaldehyde 5 ح ضر الكاشف بإذابة ( ) غ ارم من مادة في 25 Isoamyl alcohol ) مللتر من كحول ايزواميلي ( (, ثم أ ضيف إليه ( ) مللتر من 75 ( حامض الهيدروكلوريك المركز ببطء ليصبح لون الكاشف أصفر شاحب حف في قناني معتمة م درجة ح اررة في 4 لحين اإلستعمال, ثم إست عمل للكشف عن قابلية البكتريا على إنتاج حلقة االندول 2005(, )Brown كاشف أحمر المثيل Methyl red reagent 300 حضر بإذابة 01 غ ارم من أحمر المثيل في مللتر كحول أثيلي % 95 ثم أضيف إليه مللتر ماء مقطر ثم حف في قنينة معتمة في درجة ح اررة º4 م لحين االستعمال 200 ) Collee et al,1996 ( كاشف فوكس بروسكاور Voges-Proskauer reagent يتكو ن من محلولين هما : المحلول األول: 40 حضر بإذابة غ ارمات من هيدروكسيد البوتاسيوم في الماء منزوع األيونات

47 الفصل الثالث المواد وطرق العمل المحلول الثاني: حضر بإذابة غ ارمات من ( مللتر من )α-naphthol في 100 االيثانول 5 المطلق كاشف االوكسيديز Oxidase reagent ح ض ر الكااشف أنيا عاند االساتخادام و ذلك بااااااااإذابة )1( غاااااااام مااااااااااااان ماااااااادة N-N-N-( )N- Tetra methyl para phenylene diamine dihydro chloride فااااااي 100 مللتر مان الامااء المقطر في قنيناة غاماقاة ومعتماة, أستعمل للكشاف عن قابلياة البكتاريا على إنتااج أناازيام االوكسيديز 2005(, )Brown كاشف الكاتليز Catalase reagent إستعمل الكاشف انزيم إنتاج إلختبار الكاتاليز وهو عبارة عن محلول %3 من بيروكسيد ( Maza et al, 2004) الهيدروجين H 2 O كاشف اخت ازل النت ارت ويتكون من:- أ- محلول : ح ضربأذابة غ ارم من 50 مللتر في الحامض 8 Sulfanilic acid من حامض الكبريتيك المركز واكمل الحجم الى 1 لتر من الماء المقطر 50 5 α - Naphthylamine ب- محلول : ح ضر باذابة غ ارم من المادة في مللتر من حامض الخليك عياري واكمل الحجم الى 1 لتر من الماء المقطر عند 5 االستعمال يمزج حجم متساو من محلول أ ومحلول ب 7 تحضير المحاليل محلول الملحي الفسلجي حضر المحلول بإذابة غ ارم من مادة كلوريد الصوديوم في 90 مللتر من الماء 085 المقطر, وأكمل الحجم إلى مللتر وعقم بالموصدة بدرجة ح اررة م ولمدة 15 دقيقة )Cruickshank et al,1975( وحف 4 بدرجة ح اررة م واستخدم في إج ارء التخافيف المطلوبة

48 الفصل الثالث المواد وطرق العمل محلول دارئ الفوسفات الملحي 002M Phosphate Buffer Saline (PBS) ph:72 ح ضر بإذابة المواد اآلتية ( 02 غم فوسفات البوتاسيوم ثنائية الهيدروجين غم فوسفات البوتاسيوم احادية الهيدروجين 8 غم كلوريد, K 2 HPO 4 12,KH 2 PO ) الصوديوم NaCl مللتر في من الماء المقطر وبعدها عدل الرقم الهيدروجيني إلى أ كمل الحجم إلى 1000 مللتر ووضع بقنينة محكمة السد وعقم بالموصدة ثم حف بالثالجة لحين االستعمال (Anone,1993) MacFarland standard محلول ثابت العكرة القياسي 05 ح ض ر هذا المحلول باذابة 1175 غ ارم من كلوريد الباريوم في كمية من الماء المقطر إلى A وأكمل الحجم 100 مللتر بالماء المقطر وسمي المحلول ( ) وأضيف واحد مللتر من حامض الكبريتيك المركز إلى كمية من الماء المقطر وأكمل الحجم إلى 100 مللتر بالماء )A) 005 ) المقطر وسمي المحلول (B ولتحضير مزج تم العالق مللتر من محلول مع مللتر )B( في أنبوب اختبار وحف في الظالم وتم مزج محتويات األنبوب قبل االستعمال 995 لمعايرة عدد الخاليا البكتيرية al,2006( )Morello et 2-3 ط ارئق العمل جمع العينات )5-3( جمعت 75 كما يبين عينة الجدول شملت عينات الدم والبول والقشع ومسحات الجروح والحروق باوعية خاصة معقمة من الم ارجعين الربع مستشفيات وهي )مستشفى بغداد التعليمي / مدينة الطب ومستشفى ابن بلدي ومستشفى اليرموك التعليمي ومستشفى حماية 2015/4/1 للمدة من الطفل( 2014/11/4 ولغاية

49 الفصل الثالث المواد وطرق العمل نوع وعدد عينات البكترية التي جمعت الد ارسة أثناء : ) جدول )3-5 نوع العينة عدد العينات 18 Blood الدم 17 الجروح Wound Burn Urine Sputum حروق البول القشع 75 المجموع الكلي عزل بكتريا )Streaking) زرعت العينات المأخوذة بوساطة الناقل المعقم وبطريقة التخطيط على وسطي اكار الماكونكي واكار الدم وبمعدل مكررين للعينة الواحدة, ح ضن االول بدرجة ح اررة Isolated (24) واالخر م (44) ولمدة م ساعة للحصول على مستعم ارت منفردة (37) colonies تشخيص العزالت التشخيص بالطرق التقليدية ش خصت العزالت البكتيرية اعتمادا على الصفات الزرعية والمجهرية واالختبا ارت (2009( الكيموحيوية واعتمادا على ما ورد في Goldman and Lorrence يأتي :- وكما

50 الفصل الثالث المواد وطرق العمل أ-الصفات الزرعية ش خصت المستعم ارت المنفردة التي نمت في الزرع االولي للعينات تشخيصا أوليا, وذلك اعتمادا على الصفات الزرعية لتلك المستعم ارت من شكل وحجم ولون ونوع وظهور النمو في درجة ح اررة 44 م ب- الفحص المجهري تم الفحص إعتمادا على صبغة غ ارم وذلك بنقل جزء من المساتعمرة البكتيرية النامية على وسط االكار المغذي بعمر )18-24( ساعة بدرجة 37 م ح اررة الى شريحة زجاجية نظيفة, فرشت وتم تثبيتها باللهب بعدها صبغت بصبغة غ ارم, وفحصت بالمجهر الضوئي المركب لمالحظة شاكل الخااليا وانتظامها واحجاماها وقابلية إصطباغها بصابغة غ ارم وبعد التاكد من نقاوة هذه المستعم ارت نقلت الى وسط المغذي السائل broth( )Nutrient وحضنت بدرجة ح اررة 37 م االختبا ارت الكيموحيوية أج ريت االختبا ارت على وفق الطريقة التي بينها (2007) وكما Forbes etal, يأتي:- أ- اختبار انزيم االوكسيديز ن قلت مسحة من العزالت النامية على وسط االكار المغذي بعمر 24 ساعة باعواد خشبية ) ( معقمة ونشرت على ورق ترشيح واضيف 4-2 قط ارت من كاشف فقرة الخاص ولوح تحول لون العزالت الى البنفسجي الغامق في اثناء ثانية دليال على ايجابية االختبار استخدم االختبار لتفريق سالالت البكتريا المعوية التي تتميز بعدم امتالكها لهذا االنزيم

51 الفصل الثالث المواد وطرق العمل ب- اختبار انزيم الكاتاليز H 2 O 2 أ خذت قطرة من محلول كاشف %3 بيروكسيد الهيدروجين ووضعت على شريحة زجاجية نظيفة, م زجت مع جزء من المستعم ارت الم ارد اختبارها والنتيجة الموجبة هي ظهور فقاعات غازية اس تخدم االختبار للتحري عن امتالك العزلة النزيم الكاتاليز والذي يحفز على تحرر االوكسجين من بيروكسيد اليهدروجين TSI ت- اختبار ثالثي السكر الحديد الذي الجاهز والحديد السكر ثالثي اكار وسط استعمل حضر وفق تعليمات الشركة باذابة 65 غ ارما من الوسط في لتر واحد من الماء المقطر, وعدل الرقم الهيدروجيني الى 72, ووزع على انابيب زجاجية وعقم بالموصدة ثم ترك بعد ذلك ليتصلب بشكل مائل مع وجود قعر, تم, القعر الوسط طعن درجة عند الوسط وح ضن المائل الوسط سطح على البكتريا من جزء ونشر, م ح اررة 37 ولمدة 24 لتخمر نتيجة الغاز تكوين على داللة غازية فقاعات ظهور ساعة H, 2 S وتق أر النتائج الكلوكوز كبريتيد غاز انتاج على داللة االسود اللون وظهور الهيدروجين كاالتي لون المائل لون القعر النتيجة تخمر الكلوكوز فقط تخمر الكلوكوزوالالكتوز او الكلوكوز والسكروز او تخمر الثالثة معا K A A A ال يوجد تخمر K K اس تخدم الوسط لعدة اختبار ات اذ اس تخدم للتفريق بين انواع البكتريا المخمرة لسكريات الالكتوز والكلوكوز والسكروز او التي تخمر الكلوكوز فقط, وذلك بتغير لون الوسط الى االصفر الذي يدل على النتيجة الموجبة, فضال عن اختبار قدرة العزالت البكتيرية على انتاج غاز كبريتيد الهيدروجين )S H( 2 اذ يكون االخير ارسبا اسود من )FeS( في قعر انبوبة االختبار

52 الفصل الثالث المواد وطرق العمل اختبار االندول ث- أ جري بتنمية البكاتريا في وسط االندول الم حضر في الفقرة ) ( مدة ساعة وبدرجة ح اررة م ثم أضيف للوسط 05 مللتر من كاشف كوفاكس الم حضر في الفقرة ) ( ظهور حلقة حم ارء اللون دليل على ايجابية الفحص ج- اختبار المثيل االحمر نميت البكترياا في وسط المثيل األحمر الم حضر في الفقرة ) ( وحضانت مدة ساعة وبادرجة ح اررة م ثم أضيفت إلى الوسط 3-2 قطرة من كاشف المثيل األحمر الم حضر في الفقرة ) (, تغير لون الوسط الى األحمر يدل على ايجابية الفحص اختبار ح- Voges-Proskauer ح ضر وسط فوكس- بروسكور )MR-VP( ول قح بالعزلة البكترية وحضن عند درجة م ولمدة ح اررة ساعة ثم أضيف بعد ذلك 1 مللتر من المحلول األول و 3 مللتر من المحلول الثاني الم حضرين في الفقرة ) ( إلى الوسط مع الرج تغير لون الوسط إلى اللون الوردي اثناء 5-2 دقائق داللة على ايجابية الفحص, يجرى الفحص لمعرفة قدرة العزلة البكتيرية على تكوين األسيتون كناتج تحلل السكريات خ-اختبار استهالك الست ارت استعمل في هذا االختبار وسط الجاهز الذي حضر وفق تعليمات Simmons' citrate الشركة بإذابة غ ارم من الوسط في مللتر من الماء المقطر وعدل الرقم الهيدروجيني إلى واكمل الحجم الى 1 لتر ثم وزع على انابيب زجاجية وعقم بالموصدة ثم ترك بعد ذلك ليتصلب بشكل مائل, لقح الوسط بالعزلة البكترية وحضن عند درجة ح اررة 37 م ولمدة ساعة, يعد تحول لون الوسط من األخضر إلى األزرق مع ظهور نمو بكتري داللة على النتيجة

53 الفصل الثالث المواد وطرق العمل الموجبة اس تخدم االختبار لغرض معرفة قابلية العزلة البكترية على استهالك الست ارت كمصدر للكاربون والطاقة وعلى استهالك أمالح االمونيوم كمصدر للنيتروجين اختبار الحركة د- ل قح وسط الحركة media) )Motility الم حضر في الفقرة ) ( بالبكتريا º37 بشكل طعنة )Stab( ثم حضن الوسط مدة ساعة وبدرجة ح اررة يدل انتشار م النمو حول مكان الطعنة على إن البكتريا متحركة إما إذا كان النمو في مكان الطعنة فقط فيعني إن البكتريا غير متحركة ذ- اختبار انزيم اليوريز زرعت العزلة البكترية الم ارد اختبارها على وسط أكار اليوريا المائل الم حضر في الفقرة 24 ) ( وحضنت عند درجة ح اررة 37 م ولمدة ساعة تغير لون الوسط من االصفر الى الوردي االرجواني داللة على اف ارز العزلة البكتيرية النزيم اليوريز ر- اختبار اماعة الجيالتين ل قحت انابيب وسط الجيالتين بالعزالت النامية بطريقة الطعن )Stab( وحضنت عند درجة م لمدة ساعة ثم وضعت في الثالجة عند درجة م لمدة 30 دقيقة, والنتيجة º37 الموجبة هي تحول الوسط الى الحالة السائلة ز- اختبار اخت ازل النت ارت ل قحت انابيب مرق النت ارت Nitrate broth بالعزالت النامية وحضنت في درجة ح اررة 37 م ( أ ضيف ساعة ثم مدة 24 ميلتر من خليط محلولي ( أ, ب ) الم حضر في الفقرة (1-3 والنتيجة الموجبة تغيير لون الوسط الى االحمر بضع دقائق في مالحظة: أ جري اختبار السيطرة لكل االختبا ارت المذكورة اعاله

54 الفصل الثالث المواد وطرق العمل Api 20E س- التشخيص باستخدام نظام النظام يعتمد على )20( فحص وحسب تعليماات الشاركة المصانعة,)Biomerieux( فبعاد عمال عاالق البكترياا الما ارد تشخيصاها بحيات تكاون درجاة العكاورة مطابقاة McFarland( 05( أ ضيف جزء من العالق لكل االختبا ارت التشخيصية و لكل انبوب وصوال الى الحفرة عدا االنابيب وGEL و CIT التاااي ملتااات تماماااا واضااايف الزيااات الخااااص بالعااادة الاااى االنابياااب ADH و VP Api و URE للحصول على ظروف الهوائية, حضن بعد ذلاك شاريط بعاد اضاافة H 2 وS LDC, 24 قلياال ماان الماااء علااى قاعاادة العلبااة لتااوفير الرطوبااة بدرجااة حاا اررة 37 م لماادة وبعااد ساااعة VP1 انتهاااء ماادة الحضاان اضاايفت الكواشااف ابتااداء ماان اختبااار VP بقطاارة واحاادة ماان كواشااف وبعد وVP2 10 دقائق تم ق ارءة النتيجة, ثم اضيفت قطرة من كاشف )TDA( الى انبوبة اختباار )TDA( وق ارءة النتيجة بعد 5 دقائق اما اختبار االندول )IND( فقد تام باضاافة قطارة مان كاشاف -2-3( االندول ودونت النتيجة بعاد دقيقتاين وتام فحاص االوكسايديز بالطريقاة الماذكورة فاي فقارة 2-3- أ ) باستعمال كاشف االوكسيديز وعند اكتمال تادوين النتاائج علاى ورقاة التقريار اعتماادا علااى جاادول قاا ارءة النتااائج تاام مطابقتهااا مااع شاافرة خاصااة للنمااوذج مثبتااة فااي اسااتمارة المعلومااات المرفقة مع عدة Api لغرض التشخيص تبعا لما تحمل هذه الشفرة من تسلسال رقماي مكاون 20E ماان ارقااام, ثاام قورناات مااع النتااائج المدرجااة مااع دلياال فهاارس النتااائج Profile( )Index يبااين 7 Benson, 2002 ; تشاخيص النمااذج مان جانس وناوع وحساب تعليماات الشاركة المصانعة ( ) Forbes et al, فحص حساسية بكتريا A baumannii للمضادات الحيوية أتبعات طريقاة method( )Disc diffusion فاي تحدياد حساساية البكترياا لسابعة مان )Microdilution method( مضاد أما للمضادات الكولستين أ تبعت طريقة Disc diffusion method 1-3-3, ن ميات العاازالت Mueller-Hinton مارق فااي بدرجاة حاا اررة م ولماادة ساااعة قورناات عكاارة النمااو البكتااري فااي األنابيااب مااع عكاارة محلااول العكاارة القياسااي إلعطاااء عاادد تقريبااي

55 الفصل الثالث المواد وطرق العمل 8 للخاليا الحية مساويا الى 15x10 خلية/ مللتر, ثم نقل مللتر 01 من العالق البكتياري ونشار بشاكل متجاانس علاى وساط اغاار, بعادها وزعات أقا ارص المضاادات Mueller- Hinton بواسااطة ملقااط معقاام علااى سااطح الوسااط بصااورة منتظمااة وحضاانت اإلطباااق بدرجااة حاا اررة 37 م لمدة ساعة سجلت النتائج بقياس قطر منطقة التثبيط باالملمتر حاول كال قارص بعادها قورنات النتاائج بالمعادالت القياساية لقطار منطقاة التثبايط للمضاادات الحيوياة وفاق الطارق العالمياة ) CLSI,2011( Microdilution method حضاار عااالق بكتااري بإختيااار ثالثااة الااى خمااس مسااتعم ارت لهااا الخصااائص علااى نفسااها الطباق اغاار الناقال بواساطة ونقلات لتلقايح انابياب حاوياا علاى 5 مان مللتار Mueller-Hinton المرق نميت العزالت بدرجاة حا اررة ولمادة م سااعة, وتام معاايرة عكاورة المازروع البكتاري مع معدل الق ارءات 0062 التي تم الحص ول عليها من اخذ عدد من الق ارءة لعدد انابيب حاوياا علااى عااالق بكتيااري قورناات بااالعين المجااردة مااع محلااول ثاباات العكاارة القياسااي المحضاار بااالفقرة ) ( وتثبيااات القيماااة بعاااد قااا ارءة االنابياااب بجهااااز االمتصاصاااية بطاااول ماااوجي 600 نانومتر المقارنة مع عكورة محلول ثابات العكارة القياساي إلعطااء عادد تقريباي للخالياا الحياة مسااويا Mueller الااى 15x10 خليااة/ مللتر,خفااف العااالق بنقاال ماان ماارق مللتاار الااى 1 مللتاار للحصول علاى عادد خالياا /مللتار خلياة المضااد خففات بسلسالة التخاافيف 6 5x10 Hinton 05 الثنائية من 64 الى مايكروغ ارم ما يكروغ ارم 50 Microtiter plate أ ضاايفت تخاااافيف المضااااد الاااى صااافائح العيارياااة الدقيقاااة بحجااام 5 5x10 مايكرولتر بعدها يضاف 50 مايكرولتر من العالق البكتري للحصاول علاى عادد خالياا خلية/ مل, حضنت الصفائح بدرجة ح اررة م ولمدة ساعة )CLSI,2011( بعادها تام Absorbance ق ارءة النتائج MIC لتحدياد باساتخدام جهااز قاارئ امتصاصاية الصافائح الدقيقاة عند طول موجي 600 نانومتر Microplate Reader

56 الفصل الثالث المواد وطرق العمل 4-3 تصميم الببتيدات المضادة للبكتريا اعداد مكتبة صغيرة من الببتيدات المضادة للبكتريا تام انشااء مكتباة صاغيرة إساتنادا اشارت الى الببتيدات إلاى المعلوماات تام الحصاول عليهاا مان المضادة للميكروبات ضاد بكترياا A baumannii در اساات ساابقة اضاافة الاى معلوماات ماااااااااااااااااااااااااااااان قاعاااااااااااااااااااااااااااااادة البيانااااااااااااااااااااااااااااااات للببتياااااااااااااااااااااااااااااادات المضااااااااااااااااااااااااااااااادة للميكروبااااااااااااااااااااااااااااااات APD ( والهاااادف هااااو الببتياااادات المضااااادة للميكروبااااات, الفعالااة ضااد البكتريااا السااالبة الصاابغة غاا ارم ان المواقااع المشااار اليهااا ال يوجااد فيهااا تفضاايل بااين الببتيدات من ناحية الخصائص الفيزيوكيميائية من اجل رسم صورة شاملة عن الببتيدات المضادة AMPs للميكروبات, لذا تم تحليل الخصائص الفيزيوكيميائية لكل في المكتباة موقاع بأساتخدام APD فضال عن مواقع : بأسااتخدم هااذا الموقااع للتنبااؤ بقابليااة الببتياادات فااي اختاا ارق الخاليااا والعديااد ماان CellPPD * الخواص الفيزيو كيميائية ( ) (Gautam et al, 2015) Helical wheel موقع * Projections Helical Wheel لرسم عجلة الحلزونية projection للببتيدات المصممة والذي يبين الوجوه القطبية وغير القطبية ) ) افت ارض قالب 2 للببتيدات وقياس خصائصها حاسوبيا -4-3 صممت الببتيدات بإفت ارض قالب ضمن المواصفات العامة باستخدم العديد من قواعد بفعاليتها لتنبؤ البيانات

57 الفصل الثالث المواد وطرق العمل قاعدة التنبؤ بتواليات الببتيدات المضادات الميكروبات فضال عن معلومات متنوعة CAMP R3 * )Waghu et al, 2015( ) تم استخدتم هذا الموقع للتنبؤ بسمية الببتيدات لخاليا المضيف والعديد من ToxinPred* الخواص الفيزيو كيميائية Sudheer et al, ( ( ( ) 2013 موقع للحصول على ملف PDB الذي يحدد التركيب الثالثي االبعاد للببتيدات PEPstr* )Kaur and Raghava, 2007 ( ) استخدمت قاعدة للحصول على معلومات عن Protein Data Bank - RCSB PDB * ) الببتيدات ) تم استخدتم هذا الموقع لقياس الك ارهية للماء وصافي الشحنة HeliQuest* ) *استخدام برنامج BioEdit Sequence Alignment Editor 725 لقياس ك ارهية, الببتيدات للماء Kyte-Doolittle scale ومحتوى الببتيدات من االحماض االمينية Discovery Studio 350 فضال عن استخدام برنامج إلظهار شكل ثالثي االبعاد PDB وشبكة الهيدروجين للببتيدات المصممة باالعتماد على ملف 5-3 الببتيدات بناء Peptide synthesis قامت الشركة الصينية Beijing SBS Genetech تواليات اربع ببناء للببتيدات Mastoparan المضادة للميكروبات المصممة اضافة الى الذي تم استخدامة بمثابة سيطرة Control ) )

58 مº الفصل الثالث المواد وطرق العمل 6-3 قياس فعالية الببتيدات المضادة للميكروبات المصصمة A baumannii ح ددت فعالية الببتيدات بتطبيقها على بكتريا عزالت بطريقة قياس التركياز المثبط االدناى (MIC) Minimal inhibitory concentration أقال تركياز ماان وهااو Microdilution method الببتيد يحول دون نمو البكتريا اعتمدات طريقة الموصى بهاا كماا في الفقرة )2-3-3( 7-3 قياس فعالية تحلل الدم (HC50) Hemolytic activity Hemolysis ح اادد مياال الببتياادات لتحلياال الاادم علااى باالعتماااد وذلااك تحلياال نصااف عاادد الخاليا الدم االنموذج في لالنسان الحمر عينات الدم الطاازج ا دخلات الاى جهااز النباذ المركازي Revolutions per minute 2500 لمادة 5 دقاائق بسارعة دورة بالدقيقاة )RPM(, ال ازلاة بقية مكونات الدم, الكريات غس تل ثم ثاال ما ارت بمحلاول دارئ الفوسافات الملحاي المحضار 2500 بااالفقرة ) ( لماادة 5 دقااائق وبساارعة دورة بالدقيقااة لكاال ماارة, عااالق ماان حضاار \ كريات الدم الحمر %2 بتركيز بأضافة كريات الدم الى دارئ الفوسفات ( حجم حجم( حضاارت سلساالة ماان تخااافيف الثنائيااة للببتياادات بمحلااول دارئ الفوساافات الملحااي ماان 100, ماااايكروغ ارم 50 الاااى ماااايكروغ ارم اضااايف مللتااار مااان عاااالق خالياااا الااادم الحمااار 1600 %1 فاي مللتار و 100 مان تخاافيف الببتيادات الاى انابياب اختباار لتكاون نسابة خالياا الادم الحمار كااااال انباااااوب االختباااااار وت اركياااااز التخاااااافيف الثنائياااااة للببتيااااادات باااااين ماااااايكروغ ارم الاااااى 2 ماايكرغ ارم, ح ضار أنباوب السايطرة الموجباة بأضاافة مللتار مان عاالق خالياا الادم الحمار الاى مللتر من الماء المقطر ( لتحلل الخاليا بصاورة كاملاة ), وأنباوب السايطرة الساالبة أضاافة 198, مللتاار ماان عااالق خاليااا الاادم الحماار 198 ماان مللتاار الااى دارئ الفوساافات الملحااي ح ضاات انابياااب سااااعة لمااادة االختباااار بدرجاااة حااا اررة ثااام ادخلااات االنابياااب الاااى جهااااز النباااذ المركزي لمدة 5 دقائق بسرعة دورة بالدقيقة, ا خذ ال ارشح وا ضيف مايكرولتر الاى كااال حفااارة مااان حفااار صااافائح العيارياااة الدقيقاااة لقااا ارءة النتاااائج بإساااتخدام جهااااز قاااارئ امتصاصاااية الصفائح الدقيقة 570 عند طول موجي نانومتر

59 الفصل الثالث المواد وطرق العمل -: ح سبت نسبة تحلل الدم االتية المعادلة وفق امتصاصية االنموذج امتصاصية السالبة السيطرة امتصاصية \ السيطرة % لتحلل الدم = ( 100 ) الموجبة امتصاصية السيطرة السالبة يااتم تحديااد مياال الببتياادات لتحلياال نصااف عاادد الخاليااا برساام نساابة الاادم تحلاال الاادم مقاباال تركيااز ) الببتيدات ) al,1978 Ziqing et al, 2014; Strong et Therapeutic Index حساب 8-3 مؤشر العالجية )TI( تم حساب مؤشر العالجية بطريقتين االولى بطريقة حاسوبية والثانية بطريقة مختبرية اذ تم استخدام موقع Therapeutic index estimator للطريقة الحاسوبية ) مختبريا تم حساب مؤشر العالجية بالمعادلة االتية :- MIC \ HC50 = ) TI مؤشر العالجية ( تركيز : الببتيد المسبب لتحلل نصف خاليا الدم الحمر HC50 : التركيز المثبط االدنى MIC

60 الرابع الفصل النتائج والمناقشة

61 الفصل الرابع النتائج والمناقشة -4 النتائج والمناقشة Results and Discussion 1-4 تشخيص بكتريا A baumannii التشخيص الزرعي 75 عن التحري تم بكتريا A baumannii عينة من في مصادر تتضمن الدم البول 50 بكتريا A baumannii الحروق جروح والقشع تم الحصول على من عزلة بنسبة إذ شخصت العزالت تشخيصا اوليا اعتمادا على صفات المستعم ارت على االوساط % 6666 الزرعية وقد امتازت مستعم ارت A baumannii بكونها صغيرة عند تنميتها فاتح بلون وردي على وسط الماكونكي في حين ظهرت على وسط اكار الدم المستعم ارت رصاصية وغير فاتحة حالة للدم لعدم قابليتها على انتاج الهيمواليسين جميع عزالت بكتريا A baumannii كانت لها القابلية على النمو بدرجة ح اررة 44 م 44 اللون الوردي الفاتح على اكار المكونكي ونمو بدرجة ح اررة م يعدان صفتين Acinetobacter فسلجية تميز النوع A baumannii عن بقية االنواع العائدة لجنس ) Peymani et al 2012 ( الفحص المجهري ظهرت الخاليا في الفحص المجهري للش ارئح المحضرة من مستعم ارت البكتريا بشكل عصيات قصيرة صغيرة) Coccobacilli ( غالبا ما تنتظم بشكل أزواج أو قد تكون مفردة لصبغة وسالبة )Holt et al,1994 ك ارم ( االختبا ارت الكيموحيوية اظهرت االختبا ارت الكيموحيوية لبكتريا A baumannii الموضحة في الجدول امتالك العزالت إنزيم الكاتاليز الذي يحول بيروكسيد الهيدروجين H 2 O 2 إلى ماء )1-4( وغاز وجميع البكتريا الموجبة لهذا الكشف تستخدم االوكسجين كمستقبل نهائي للكترونات في O 2 عملية التنفس الهوائي

62 الفصل الرابع النتائج والمناقشة واظهرت النتائج عدم امتالكها إنزيم االوكسيديز لعدم ظهور اللون البنفسجي على ورق انزيم انتاج على غير قادرة كما انها الترشيح يحطم الحامض أألميني التربتوفان لذلك لم تظهر حلقة حم ارء بنسبة لفحص االندول ولم يتغير لون الوسط إلى األحمر عند اضافة كاشف المثيل األحمر كذلك لم يتغير لون الوسط الى االحمر في فحص فوكس بروسكاور لعدم قابلية العزالت على Acetyl-methyl carbinol انتاج نتيجة استخدامها الكلوكوز في حين استطاعت البكتريا ان تستهلك الست ارت كمصدر وحيد للكربون والطاقة نتج الذي عنه تغيير لون الوسط من األخضر إلى األزرق وبالنسبة للنمو على وسط أغار الحديد ثالثي A baumannii (TSI السكريات ( بكتريا فأن ال تستطيع النمو في قعر الوسط كونها بكتريا هوائية مجبرة وكذلك عدم قدرتها على استهالك السكريات الموجودة في الوسط ) Constantiniu et al 2004( و يعد فحص الحركة من الفحوص الهامة التي تميز بكتريا Acinetobacter عن غيرها من البكتريا المتحركة على الرغم من عدم قدرة بكتريا على الحركة اال انها تمتاز بنوع من الحركة على السطح الصلب تسمى الحركة االرتعاشية Twitching motility إذ تقترن هذه الحركة بوجود االهداب القطبية 2006) al (Gohl et جدول )4-1( : نتائج االختبارات الكيموحيوية لتشخيص A baumannii المعزولة من عينات سريرية بكتريا

63 الفصل الرابع النتائج والمناقشة االختبار النتيجة k/k اختبار الكاتليز اختبار االوكسيديز اختبار انتاج االندول اختبار احمر المثيل اختبار فوكس بروسكار استهالك الست ارت استهالك السكريات الثالثية انتاج H 2 S القابلية على الحركة اختبار اليوريز اخت ازل النت ارت )+( الفحص موجب )-( الفحص سالب وقد تطابقت نتائج التشخيص الزرعي والمجهري والكيموحيوي مع ماورد في د ارسات اخرى )Holt et al,1994( التشخيص باستخدام نظام Api 20E إستخدمت عدة Api 20E التشخيص التي تمتاز بسهولة ودقة التشخيص وذلك لتأكيد نتائج الفحوص الكيموحيوية وقد جاءت نتائج الفحص مطابقة لنتائج الفحوص الكيموحيوية 20 الموضحة في ملحق )1( تم ق ارءة إذ وتسجيل النتائج االختبا ارت ال التي يتكون منها هذا analytical profil index Api 20E النظام التشخيصي وبعدها فسرت بالرجوع الى تم الحصول على 50 عزلة بكتيرية مشخصة تعود للنوع A baumanni توزيع عزالت بكتيريا A baumannii وفق نوع العينات

64 الفصل الرابع النتائج والمناقشة A baumannii ) يبين الجدول )4-2 توزيع عزالت بكتريا تم إذ العينة نوع وفق الحصول عليها من مختلف العينات البول عينات منها وجروح وقشع ودم وحروق كان اعلى معدل لهذه البكتريا في عينات الدم بنسبة %30 اما ثاني اعلى نسبىة كانت عينات في الجروح %26 وقد يعود السبب الى ان هذه البكتريا تعد من الممرضات االنتهازية اذ انها تنتهز فرصة حدوث اختالل عام أو موضعي في دفاعات الجسم ويمكن ان تكتسب من داخل المستشفى بسبب تجاهل العاملين والكادر الطبي تعقيم االدوات الطبية وكذلك قد يعود السبب تلك الكوادر ايدي على البكتريا هذه وجود الى مما يسبب انتقالها بين المرضى ال ارقدين في المستشفيات ولا تقارب النسبي عينات بين الجروح وعينات الدم قد يشير الى انتقالها من الجروح الى مجرى الدم الى مجرى الدم تنتقل كما يمكن اثناء العمليات الج ارحية اهمال النظافة بسبب والتعقيم قبل وبعد اج ارء العملية )2013( Al-Ajeeli )1996( اشار وقد al, Jawad et و الى ان بكتريا العدوى في من مسببات المستشفيات اذ تكون موجودة على ايدي الكادر A baumannii الطبي وفي بيئة المستشفيات هذا وقد يعود لقدرتها الكبيرة على مقاومة الجفاف والبقاء على العينات من عزلها معدل اما االسطح الحروق فقد سجلت %20 من مجموع العزالت اذ اشار الى ان بكتريا A baumannii من البكتريا المسببة الصابات )2008 ( Joly-Guillou %12 الحروق في المستشفيات وقد بلغ معدل عزلها من المسالك البولية المسالك التنفسية و )2014( Hadi منهما لكل اتفقت النتائج الى حد ما مع ما توصل اليه الع ارق اذ في بلغت نسبة عزل بكتريا A baumannii في د ارستها من عينات الجروح %30 ونسبة عينات Essa Musafer and الحروق والقشع بلغت %10 لم تتفق النتائج لما توصل اليه %4762 فيما اذ بلغت نسبة عزالت بكتريا A baumannii من مسحات الجروح )2013( Al كانت النسبة من عينات %2857 والقشع البول على التوالي نتائج مع وايضا التي اشارت الى ان اعلى نسبة تم الحصول عليها في عينات الجروح )2013 ( Ajeeli % 4117 بينما كانت اقل نسبة في عينات الدم وقد يعود السبب الى اختالف عدد % 588 العينات المأخوذة ومدة جمع العينات وكذلك البيئة التي عزلت منها العينات والظروف الصحية التي يعيش فيها المرضى

65 الفصل الرابع النتائج والمناقشة جدول )4-2 ) : توزيع العزالت لبكتريا Abaumannii وفق نوع العينات نوع العينة عدد العزالت النسبة المئوية )%( Blood الدم الجروح Wound Burn حروق 12 6 Urine البول 12 6 القشع Sputum المجموع الكلي 3-4 فحص حساسية بكتريا A baumannii للمضادات الحيوية حدد حساسية بكتريا A baumannii للمضادات الحيوية باالعتماد على الطريقة العالمية فقد اتبعت طريقة method( )Disc diffusion في تحديد حساسية البكتريا لسبعة من )Micro dilution method( للمضادات اما مضاد Colistin فاتبعت طريقة بسبب ضعف انتشار Colistin في االكار على وجه الخصوص يؤدي مما إلى مشاكل في توحيد نتائج اختبا ارت بأستخدام طريقة انتشار Colistin اق ارص ويعود ذلك الى الوزن الجزئيي للكولستين ) 1748( العالي نوعا ما مقارنة بالمضادات االخرى )2001, al Gales et ا ظهرت نتائج اختبار حساسية بكتريا A baumannii للمضادات الحيوية مقاومة Dalton( العزالت لمعظم المضادات قيد الد ارسة كما موضح في شكل) 4-1 (

66 الفصل الرابع النتائج والمناقشة الشكل( 1-4 ) : النسب المئوية لخمسين عزلة من بكتريا A baumannii المقاومة Resistant والحساسة Sensitive ومتوسطة الحساسية Intermediat لمختلف المضادات الحيوية اظهرت A baumannii مقاومة عالية للمضاد Piperacillin(RPL) التابع لمجموعة مضادات وجاءت هذه النتيجة متوافقة مع ما اورده الباحثون في الع ارق Hammood β-lactams وبلغت نسبة المقاومة في د ارستهم 9130% كما اتفقت هذه النتيجة مع )2013( et al, Brisse et al, 2000) ما اورده الباحثون في المانيا ( اذ بلغت نسبة المقاومة في د ارستهم Prashanth and Badrinath مع ما اتفقت وكذلك توصل اليه كل من الباحثين %90 في الهند فقد كانت نسبة المقاومة مقاربة لما تم التوصل اليه حاليا اذ بلغت )2004( Cefotaxime كما اظهرت عزالت A baumannii مقاومة عالية لمضاد %922 β-lactams ضمن مجموعة السيفالوسبورينات المرتبطة كيميائيا مع عائلة (CTX) واتفقت النتيجة الى حد ما مع د ارسة محلية اجريت في (2010 من قبل الباحثة اذ المشهداني ) Meropenem بلغت نسبة المقاومة %100 كما ان العزالت اظهرت مقاومة مرتفعة للمضاد التابع لمجموعة مضادات المرتبطة Carbapenems بمضادات البيتاالكتام وهذا (MEM)

67 الفصل الرابع النتائج والمناقشة A مخالف لما توصلت إليه الباحثة عبدالكريم )2008( في الد ارسة التي اجرتها على البكتريا %100 لمضاد الى أشارت فقد ان العزالت كانت حساسة بنسبة baumannii ويعود السبب الى الفارق الزمني بين الد ارستين وقد يعزى السبب الى Meropenem االستخدام المفرط والعشوائي لهذا المضاد وغيره من المضادات وبدون استشارة الطبيب االلت ازم بالجرعة ووقتها مما يعطي الفرصة لنشوء عزالت مقاومة لهذه المضادات عدم أو وبكتريا بكتريا ثنائية الغشاء Diderm األمر الذي يعني مقاومتها Abaumannii الذاتية للمضادات عموما فضال عن عدم تأثيرها يمكن كما ) Gupta,2011( β-lactams المقاومة تعود ا ن لفعل اآلليات االنزيمية إذ تمثل اآللية الرئيسة في مقاومة مضادات إنتاجها أنزيمات وهي واسعة الطيف باآلليات غير انزيمية أو β-lactamase β-lactams Outer التي تشمل تغيير نفاذية الغشاء اما بفقدان أو انخفاض تعبير بروتينات الغشاء الخارجي عن التعبير زيادة أو (OMPs) membrane proteins مضخات الدفق مما يؤدي الى منع ) Thomson etal,2005( دخول المضاد أو يعزز طرحه الى الخارج اظهرت العزالت مقاومة وصلت الى لمضاد Ciprofloxacin(CIP) الذي ينتمي %90 لمجموعة واتفقت النتيجة مع ما توصلت اليه الباحثة Hammood في Fluoroquinolones الد ارسة المحلية في عام )2013 إذ بلغت نسبة المقاومة في عزالتها الى وكانت 8348% ) %100 )2006 في ( حد ما قريبة لما توصلت اليه الباحثة الخفاجي إذ بلغت نسبة المقاومة وتقاوم البكتريا هذا النوع من المضادات عن طريق حدوث تحوير في موقع ارتباط المضاد اذ Topoisomerase IV تحدث طف ارت في الجينات المشفرة ألنزيم DNA gyrase او أنزيم المستهدفة كما تمتلك هذه البكتريا مضخات الدفق إذ تعمل على قذف المضاد خارج الخلية )Higgins et al,2004( بينت النتائج مقاومة العزالت لمجموعة التي Aminoglycosides تمثلت بمضاد نسبة المقاومة في الد ارسة مما اعلى توصل اليه كل من Hammood في وجاءت Amikacin إذ كانت نسبة المقاومة 72% و 6363% على التوالي )2013( و Al-Warid في )2014( وتحدث مقاومة المضادات هذه نتيجة لوجود مضخات الدفق أو التعبير عن انزيمات التحوير إذ تعمل تلك االنزيمات على تحوير مجموعة الهيدروكسيل االمين الموجودة ضمن أو المضاد A Cho et al, 2009 ( وبالتالي تنخفض األلفة للموقع المستهدف ( وتمتلك بكتريا

68 الفصل الرابع النتائج والمناقشة ا ض اي الجين المسؤول عن مثيلة التي تمنح مقاومة كبيرة 16S rrna لمعظم baumannii المضادات Arakawa,2007( )Doi and كما اظهرت العزالت مقاومة لمضاد في الد ارسات اشارت المحلية Tetracycline (TE) كل من في الخفاجي و في عام )2014( الى نسبة Al-Hamadani ) عام )2006 بلغت مقاومة على التوالي ومقاومة عزالت A baumannii لهذا % % المضاد تعود لوجود جين يشفر النظمة الدفق فضال عن الجين الذي يشفر لحماية الوحدة )Fluit et al 2005 ( ال اريبوسومية )30S( والذي يمنع ارتباط المضاد بها وأقل نسبة مقاومة بين العزالت سجلت لمضاد اذ بلغت النسبة % 20 وهذا ما Colistin يشير الى فعالية هذا المضاد ضد البكتريا فعلى الرغم من انتشار السالالت المقاومة لمضاد Vila and ( بكتريا A baumannii ضد نشاط على حافظ إال انه نسبة كبيرة من سالالت وقد اشارت د ارسة أجريت على عزالت تم الحصول عليها من المرضى في )Pachon,2012 المؤسسات الصحية االمريكية لمعالجة الجنود العائدين من الع ارق الى ان العزالت كانت حساسة فقط للمضادين و في د ارسة انه كما )Scott et al, 2007( Colistin Imipenem أجريت في أخرى الطبي العسكري المركز Walter Reed Army Medical Center الذي معالجة تولى الجنود العائدين من افغانستان والع ارق الى اشارت %96 من بكتريا المعزولة كانت مقاومة للعديد من المضادات وبشكل خاص الحيوية مضادات A baumannii Ceftazidime, Fluoroquinolones, Gentamicin, Imipenem, Piperacillin )Kris et al, 2007( Colistin ولعالج االصابة بالبكتريا االطباء الى يلجأ مضاد وبينت الد ارسة ان الحالية %30 من العزالت المقاومة لل Colistin كانت حساسة لكل من و (TMP) Trimethoprim-Sulfamethoxazole هذه اتفقت إذ Tetracyclin (TE) النتيجة مع الد ارسة مقاومة بأن التي اشارت الكوليستين يمكن أن تحدث تغيي ارت في نفاذية الغشاء الخارجي لصالح العوامل المضادة للج ارثيم أخرى وبالتالي ف ن العزالت المقاومة أظهرت له حساسية نحو مضادات ) (TE Amikacin (AK), Tetracyclin و مضاد Rodrigo et al, 2008 ; Laura et ( Trimethoprim-Sulfamethoxazole (TMP) )al 2014 واشار الباحثون ان تثبيط الجين المسؤول عن تخليق يؤدي الى قلة Lipid A أو فقدان انتاج قد لذلك ونتيجة )Moffatt et al, 2010( A baumannii في بكتريا LPS

69 الفصل الرابع النتائج والمناقشة يكون سببا بفقدان ألفة المضاد Colistin لغشاء البكتريا بسبب تقليل الشحنة السالبة ( et Yun )al, 2012 وقد جاءت نتائج الد ارسة متوافقة مع نتائج al, )2013( Nassar et إذ اشاروا الى ان بكتريا A baumannii مقاومة لجميع االدوية المتاحة في الع ارق لعالج االصابات أن كما العديد من الد ارسات المحلية االخرى على برهنت مقاومة بكتريا Abaumannii )Mohammed, 2013 ; Al-Hamadani et al, 2014 ; Al Sehlawi et al, 2014 ( 4-4 تصميم الببتيدات المضادة للميكروبات للميكروبات (AMPs) Antimicrobial peptides مع زيادة االهتمام بالببتيدات المضادة أو ما يسمى "المضادات الحيوية الطبيعة" والتي تبدو واعدة للتغلب على مشكلة ت ازيد المقاومة للمضادات الحيوية ال ي ازل تصميم ببتيدات مضادة للميكروبات فعالة بأستخدام ب ارمج الحاسوب, ) يشكل مجال تحدي في نهج اكتشاف االدوية الحديثة )2013, al Ryan et يتم تصميم الببتيدات المضادة للميكروبات اما بأيجاد طفرة أضافة استبدال أو حذف أو حامض اميني أو اكثر في مكان مناسب ضمن تواليات الببتيدات المضادة للميكروبات من مصادر طبيعية وبذلك يمكن ان تضفي وظائف جديدة أو تحسن من اداء الببتيد كما يمكن ان يؤدي تغير الببتيدات بهذه الطريقة الى تقليل الفعالية الببتيدات المصممة أو ظيفية ا ول يتسبب في ظهور آثار جانبية غير متوقعة وبالتالي ف ن األداء الفعلي يحتاج تحقيق تجريبي دقيق وتصمم Christopher et al, ايضا الببتيدات بأفت ارض قالب وفق المعاير االساسية كما اشار (2012) تم تصميم من الببتيدات المضادة للميكروبات في الد ارسة الحالية الموضحة في جدول 4 وذلك باالعتماد على المعلومات التي تم الحصول عليها من المكتبة الصغيرة التي انشأت )3-4( بمثابة خطوة اولى لرسم صورة شاملة عن الببتيدات التي تستهدف البكتريا سالبة لصبغة غ ارم بشكل عام ولبكتريا A baumannii خاص بشكل الموضحة في ملحق )2(

70 الفصل الرابع النتائج والمناقشة جدول )4-3 (: تواليات الببتيدات المضادة للميكروبات المصممة الببتيد التوالي الوزن الجزيئي (Da) AC-RLIRRIWRRIRW-NH2 MY AC-RIWKKIRRWWR-NH2 MY AC-RIVKRIAKKIWKC-NH2 MY AC-RWIKLIKKKVRIVR-NH2 MY AC-INLKALAALAKKIL-NH2 Mastoparan * Mastoparan الببتيد المستخدم بمثابة سيطرة في الد ارسة * ان عملية ادخال تواليات الببتيدات في ب ارمج حاسوبي وفرت امكانية ايجاد ببتيدات جديدة لم تكن في موجودة الطبيعة وقد ا درجت خوارزميات التنبؤ بتواليات الببتيدات المضادة للميكروبات النمو الى مستندة في قواعد البيانات الهائل بأستخدام عدة اساليب احصائية والتي شددت على التركيب الثانوي )Fjell وموقع االحماض االمينية في تولي الببتيد )2012 al, et لوحظ فقد ان بعض االحماض االمينية تفضل على االخرى في الببتيدات المضادة للميكروبات والسيما عند الطرف االميني والطرف الكاربوكسيلي في توالي الببتيد 2013( al, )Gautam et

71 الفصل الرابع النتائج والمناقشة خصائص AMPs الفيزي وكيمياوية تم تصميم ببتيدات مضادة للميكروبات جديدة بم ارعاة الخصائص الفيزوكيمياوية المدرجة ) الجدول) في 4-4 بدورها التي تحول الببتيدات غير فعالة الى ببتيدات فعالة ضد الميكروبات إذ اكدت الد ارسات وجود عالقة بين تركيب الببتيدات المضادة للميكروبات وطريقة عملها ومقدار نوع نشاطها او الخاليا التي تعمل عليها مع ذلك فان الببتيدات المتماثلة بالتركيب الى حد كبير Jenssen et al, ( تختلف في نوعية يمكن ان الخاليا التي تعمل عليها وآليات عملها )2006 جدول )4-4 ) : الخصائص الفيزيوكيمياوية للببتيدات المصممة في هذه الدراسة الببتيد الطول الشحنة الك ارهية للماء الصفة التقابلية Amphipathicity Hydrophobicity net charge MY MY MY MY4 وعلى الرغم ان التنبؤ قد يكون غير ممكن اقترحت بعض ولكن مبادئ التصميم العامة وفق ( البنائي الهيكل منها سابقة د ارسات للببتيدات والخصائص ي الفيزوكيمياوة الحجم صافي ك ارهية الماء والصفة التقابلية والذوبانية ) وجميعها هامة لنشاط الشحنة Net charge الببتيدات وتحديد نوعية الخاليا المستهدفة من قبل تلك الببتيدات ( 2000 al, )Tossi et

72 الفصل الرابع النتائج والمناقشة تم تصميم الببتيدات وقد في هذه الد ارسة بشحنة مرتفعة مقارنة مع طول الببتيدات الهمية الشحنة في استهداف البكتريا كما لوحظ في المكتبة المصغرة للببتيدات التي اظهرت A baumanii نسبيا على بكتريا مرتفعا نشاطا والشكل )4-2( يوضح عالقة الشحنة بالطول للببتيدات المصممة الشكل )4-2( : عالقة الشحنة بالطول للببتيدات ومن المعروف ان االكثر قبوال وجود نطاق موجب تعود اليه المسؤولية االساسية في التداخل الكهربائي المستقر بين الشحنة الموجبة للببتيدات المضادة للميكروبات والشحنة السالبة في اغشية )Yount البكتريا واالحياء الدقيقة االخرى )2006 al, et وا ستخدم في تصميم توالي )R( الببتيدات خليط من احماض االمينية الاليسين )K( واالرجنين إلضفاء الشحنة الموجبة ضمن الى +9 الحدود المقبولة والعديد من تتميز الببتيدات بامتالكها صافي شحنة من +2 بسبب Yeaman and Yount, ( )R( احتواها على االحماض االمينية الاليسين )K( واالرجنين Teichuronic Teichoic LPS اغشية البكتريا فأن بالمقابل ب الغنية وحامض أو )2003 Cardiolipin (CL) Phosphatidylglycerol اضافة الى (PG) و (PS) Phosphatidylserine جميعها تضفي شحنة سالبة على سطح البكتريا )Imrich and Katarína,2013 (

73 الفصل الرابع النتائج والمناقشة واغشية بدائيات النواة تملك جهد غشائي ( Ψ) Membrane potential عادة اعلى بنسبة 50% من ما تملكه خاليا الثديات مما رجح امكانية ت اركم الببتيدات الموجبة على الببتيد ألفة لذا فان سطح الميكروبات ترجح استهداف الكهربائية الميكروبات دون خاليا كما ان بعض اجريت على التي الد ارسات ) المضيف 2003(, Yount Yeaman and Pasupuleti et al, ( ببتيدات حلزونية اوضحت وجود عالقة بين الشحنة والفعالية الخاليا المستهدفة 1992( al, et ان إذ زيادة الشحنة يحفز الفعالية ويحدد نوعية )2008 ووفق د ارسة اجريت على Magainin 2 بتثبيت معاير شكل الحلزون والنفور من )Bessalle الماء لوحظ زيادة في الفعالية بزيادة الشحنة اذ بحدود ولكن بزيادة الشحنة الى حد +7 الى ادى )Dathe et al, 2001) انخفاض الفعالية وزيادة الميل لتحليل الدم hemolytic كما اشار اثناء تصميم الببتيدات في هذه الد ارسة اخذ بنظر االعتبار الك ارهية للماء لدورها المهم في فعالية الببتيد بتداخلها مع تصميم الببتيدات تم لذا االغشية Hydrophobicity ) 3-4( ) ) تملك الك ارهية للماء بقيم متدرجة ت اروحت بين كما مبين في الشكل مع م ارعاة عدم ارتفاعها الى الحد الذي يؤدي الى جعل الببتيد يتداخل مع خاليا المضيف أو تقل الى الحد الذي يقلل من فعالية تلك الببتيدات الشكل )4-3( : تدرج قيم كراهية الماء للببتيدات المصممة و Mastoparan

74 الفصل الرابع النتائج والمناقشة الشكل )4-4( : صفة الكراهية للماء للببتيدات المصممة ( scale ) Kyte-Doolittle يوضح الشكل المناطق الكارهة والمحبة للماء في الببتيدات باستخدام Kyte-Doolittle scale الذي يستخدم بشكل شائع للتنبؤ بمناطق الببتيد العابرة للغشاء وتشير التغي ارت في القيم الى امكانية تداخل مع المناطق الكارهة للماء في طبقة الدهون الثتائية في الغشاء المناطق ضمن القيم الموجبة تكون كارهة للماء فعلى الرغم ك ارهية من ان الماء هامة في فعالية النفوذ داخل الغشاء ان زيادة الى فقد اشير ( Yeaman and مستويات ك ارهية للماء يزيد من سميتها لخاليا الثديات ويفقدها الخصوصية ان لذا يجب تملك ك ارهية للماء معتدلة الذي بدوره يحسن نشاطها ضد (Yount, 2003 اغشية الخاليا الميكروبية كما أن تقليل الك ارهية دون الحد يقلل الفعالية ان إذ الببتيد يفشل بالمرور al,2005( )Dennison et لذا وجدار الخلية العلبة خالل للوصول الى الغشاء الخلوي عند تصميم الببتيدات يجب ان تكون ضمن الحد االمثل ويجب عند م ارعاة التصميم معيار اخر يشترك مع الك ارهية للماء في منح الببتيد امكانية التداخل مع االغشية وهو توزيع االحماض االمينية المحبة للماء والكارهة للماء ضمن الهيكل Amphipathicity البنائي للببتيد وهو ما يعرف بالصفة التقابلية إذ تتوزع االحماض االمينية

75 الفصل الرابع النتائج والمناقشة Hydrophobic ضمن هيكل الببتيد بمجال محب للماء Hydrophilic يقابلها مجال كاره للماء هذه البنية تمنح الببتيدات المضادة للميكروبات القدرة على االرتباط مع مكونات الغشاء تم وقد ) تصميم ببتيدات تملك صفة تقابلية مرتفعة بمقارنتها بالطول كما مبين في الشكل )4-5 الشكل )4-5( : عالقة الصفة التقابلية بالطول للببتيدات المصممة ويوضح الشكل) 4-6 العجلة الحلزونية للببتيدات المصممة والذي يبين Helical wheel ) الوجوه القطبية وغير القطبية وقد اختيرت مواقع محددة لألحماض األمينية التي شيدت سلسلة تكون فيها من الببتيدات االحماض االمينية الكارهة للماء بلون االصفر اما االحماض االمينية المحبة للماء بلون االزرق تواليات رسم عند ويالحظ االحماض االمينية في الببتيدات المضادة للميكروبات الطبيعية انها امتازت بامتالك صفة تقابلية التي بدورها امكانية تداخل وفرت الببتيدات متقابلة al,2006( et مع االغشية الحية التي تصطف الدهون فيها على شكل مجاميع )Yount

76 الفصل الرابع النتائج والمناقشة الشكل )4-6( :هيكل Helical wheel للببتيدات المصممة Valine R= Arginine K= Lysine الحروف تشير =A Alanine C= Cysteine I= Isoleucine W = Tryptophan V= L= Leucine N= Asparagin بمثابة المستخدم للببتيد هيكل سيطرة في الد ارسة Mastoparan * Polar المالحظ ان الجانب نسبة الكاره للماء والجانب المحب للماء وما يسمى ال ازوية القطبية angle يؤثر في نشاط الببتيدات لذا صممت الببتيدات ب ازوية قطبية كبيرة نسبيا إذ اشار )2003( Yeaman and Yount الى ان ال ازوية القطبية بين الجزئين المشحون وغير

77 الفصل الرابع النتائج والمناقشة المشحون تحدد مقدار نفوذ الببتيد داخل الغشاء وانتاج الثقوب تصميم عند ان يجب الببتيدات االخرى المعاير توخذ بنظر االعتبار تغير احدها ان إذ يمكن ان ي ؤدي الى تغير البقية وللحصول على التغيير المرغوب يتطلب ذلك تغير طفيف مع مالحظة ما أ يطر المعاير بقية على لوجود عالقة وثيقة بين تلك المعاير في تحديد فعالية الببتيد كشفت الد ارسات الحديثة على الببتيدات المضادة للميكروبات ان حلزون ألفا )α-helix( ذات بصفة تقابلية هيكل تؤدي دو ار أساسيا في نشاط تلك الببتيدات في تسهيل حلزون ألفا يساعد إذ التغلغل في الغشاء الحلزون مع تركيب ويشترك الصفة التقابلية الببتيد تلك هيكل منح في الفعالية Adam et al, ( و يقابل زيادة تأثير الببتيدات الحلزونية في السطوح السالبة زيادة سمية الخاليا )2010 MY4 MY3,MY2, MY1 لذا صمت الببتيدات بأشكال معتدلة مرنة حلزونية شكل لتقليل تاثير السمية ووزع هيكل الببتيدات بين الحلزون Helix والحلزون الممتد ) 7-4 ( والف العشوائي إذ اشارت الد ارسات الببتيدات ان الى Random coil Extended helix الحلزون ألفا بالبنية سامة لخاليا حقيقة النواة مقارنة ببتيدات يكون هيكلها البنائي على هئية صفائح مماثلة لها من ناحية الشحنة والك ارهية للماء )2005 al, )Jin et

78 الفصل الرابع النتائج والمناقشة شكل )4-7(: الهيكل الثالثي االبعاد للببتيدات المصممة الهيكل الثالثي االبعاد للببتيد المستخدم بمثابة سيطرة في الد ارسة Mastoparan * Extended helix االخضر = Helix تشير األلوان االحمر = Random coil االبيض = المعروف ان معظم بصورة تكون الببتيدات عشوائية في المحاليل المائية وفي حال اقت اربها الغشاء المستهدف تتحول الى تركيب الحلزوني وهذا التحول ضروري لتداخل االحماض االمينية Hancock and ( في الببتيد مع الجزء غير القطبي في لب طبقة الدهون الثنائية في الغشاء ومن اجل عمل الببتيدات كف ؤة مع انخفاض السمية البد ان يكون الحلزون مرن )Sahl,2006 ان إذ الهيكل الصلب يزيد في السمية دون زيادة في النشاط ان ميل االحماض االمينية في تشكيل هيكل الحلزون توخذ بنظر االعتبار عند تصميم الببتيدات على سبيل المثال البرولين Pace and Jenssen والكاليسين يكونا اقل ميال نحو تشكيل حلزون مقارنة مع االحماض االخرى ( )Scholtz,1998 لذا ال تفضل تلك االحماض عند تصميم الببتيدات الحلزونية (

79 الفصل الرابع النتائج والمناقشة ونظ ار لقصر الببتيدات المصممة تم م ارعاة امتالك تلك الببتيدات خاصية )et al, 2006 اخت ارق الخاليا لتعزيز فعاليتها فعلى الرغم من فعالية العديد من الببتيدات التي تمتاز بالقصر نسبيا اشار الباحثون الى ان انخفاض طول الببتيد يؤدي خفض الى ارتباط الببتيد إذ مع الغشاء تحتاج طول بحدود الى الببتيدات لتمتد عبر الغشاء الببتيدات القصيرة فأن وبالتالي 40Å ثقوب تشكل غير مستقرة بما فية الكفاية )2010 al, )Adam et جدول )4-5(: قيم التنبؤ الببتيدات بسمية المصممة واخت ارقها للخاليا )SVM) الببتيد اخت ارق ) )SVM السمية -102 يخترق الخلية 079 غير سام MY1-095 يخترق الخلية 051 غير سام MY2-058 يخترق الخلية 057 غير سام MY3-100 يخترق الخلية 032 غير سام MY4 يظهر التنبؤ الجدول )4-5( بقابلية الببتيدات في اخت ارق الخاليا وكذلك التنبؤ بسمية تلك الببتيدات لخاليا المضيف فقد تم إدخال العديد من األساليب الدوال أو الحاسوبية للتنبؤ Support vector machines ( SVM ( وكواحدة من تلك األساليب الدعم الموجه دالة هي التي تستخدم لتميز وتحليل البيانات من اجل تصنيفها احصائيا وتحديد الي نوع من االنواع تنتمي SVM )Xin نظ ار لعديد من الخصائص )2015 al, et وفيما يتعلق بدالة المتعلقة باخت ارق الخاليا فأن الخاليا القيم المرتفعة تدل على ارتفاع قابلية الببتيد على االخت ارق النتائج في احتمالية تبين الجدول نجاح جميع الببتيدات المصممة بأخت ارق الخاليا كما تشير الى احتمالية اخت ارق قابلية ارتفاع MY1 ببقية الببتيدات مقارنة مع للخاليا بالمقابل انخفاض احتمالية في دالة SVM االخت ارق MY4 اما بخصوص االكثر سالبية فالقيم الخاليا بسمية المتعلقة تدل وتشير لخاليا المضيف الببتيد سمية انخفاض على النتائج الموضح في الجدول )4-5( الى

80 الفصل الرابع النتائج والمناقشة MY3 انخفاض في سمية جميع الببتيدات المصممة ورجحت النتائج احتمالية ارتفاع سمية مقارنة ببقية الببتيدات الببتيدات تحوير المصممة تتحطم الببتيدات بسرعة في الجسم البشري عن طريق االنزيمات المحللة للبروتينات كذلك االنزيمات التي تستخدمها بعض الكائنات الحية الدقيقة في مواجهة Proteases دفاعية حالة بمثابة وهي الببتيدات تشكل عقبة في استخدام الببتيدات في التطبيقات الطبية ويمكن التغلب على هذة المشكلة مختلفة طرق باستخدام وعند تصمم الببتيدات اضافة تم C-terminal amidation مجموعة امين )NH2) الى النهاية الكربوكسيلية واضافة مجموعة N-terminal acetylation االستيل (CH3CO) الى النهاية االمينية في توالي الببتيد كما )2010( Nguyen et al, في الجدول )4-3( اشار وقد تأثير الى تلك التحوي ارت في زيادة استق ارر وفعالية الببتيدات فاالستلة لها اهمية بزيادة استق اررية الببتيد ضد التحلل باالنزيمات الحالة للبروتين ولكن تخفض فعالية الببتيد بالمقابل اضافة مجموعة امين لها تأثير في قليل االستق اررية لكن تزيد فعالية الببتيد ولا ببتيدات المضادة للميكروبات المصممة اضافة الى الذي تم استخدامه بمثابة Mastoparan صنعت سيطرة من قبل الشركة الصينية Genetech Beijing SBS واستخدمت الشركة الطور الصلب تصنيع في Solid phase الببتيدات و كروماتوغ ارفيا السوائل بضغط عالي (HPLC) high-pressure liquid chromatography للحصول على نقاوة اعلى من %90 الببتيدات فعالية المصممة 5-4 حددت فعالية الببتيدات بتطبيقها على عزالت بكتريا A baumannii بطريقة قياس التركي ازلمثبط االدنى وهو اقل تركيز من الببتيد يحول دون نمو البكتريا تم اختيار (MIC) عشر عزالت اظهرت مقاومة لجميع المضادات بما فيها Colistin في اختبار فحص الحساسية جدول) وعشر عزالت اخرى اظهرت مقاومة لجميع المضادات ما عدا )4-6 جدول وتم حساب المتوسط الحسابي لقيم (MIC( لرسم صورة شاملة عن )4-7( Colistin

81 الفصل الرابع النتائج والمناقشة نشاط الببتيدات واستخدم الببتيد المضاد للميكروباتMastoparan بمثابة سيطرة الن A العديد من الد ارسات في فعاليته الى اشارت عدد من انواع البكتريا ومن ضمنها بكتريا )Vila et al, 2012( baumannii وتم تحليل بعض الخصائص الفيزيوكيمياوية مثل الك ارهية للماء وصافي الشحنة والصفة لببتيد التقابلية لتفسير اسباب ارتفاع فعالية الببتيدات التي تم تصميمها ضد Mastoparan بكتريا A baumannii مقارنة بهذا الببتيد يبلغ طول الببتيد حامض اميني مماثل وهو 14 ألطوال الببتيدات المصممة مقاربة ألفا حلزون ببنية ويمتاز لبنية الببتيدات ك ارهية يمتلك كما للماء بحدود )0576( وهي اعلى من قيمة الك ارهية للماء في جميع الببتيدات التي ت اروحت بين اعلى قيمة في بحدود واقل قيمة في اما MY4 بحدود )0343( )0462( MY1 صافي وهي منخفضة مقارنة بالببتيدات المصممة التي ت اروحت بين )+6( الى ) الشحنة ( 3+ ونسبة الصفة التقابلية للببتيد بحدود )075( وهي منخفضة نسبيا مقارنة Mastoparan )7+( مع الببتيدات المصممة

82 الفصل الرابع النتائج والمناقشة A baumannii جدول) 4-6 (: Colistin نشاط المصممة ضد الببتيدات بكتريا المقاومة لمضاد جدول) 4-7 (: نشاط الببتيدات المصممة ضد A baumannii الحساسة لمضادColistin

83 الفصل الرابع النتائج والمناقشة A النتائج اظهرت وبشكل واضح فعالية الببتيدات المصممة تثبيط نمو في بكتريا مقارنة بفعالية Mastoparan إذ ت اروحت معدالت قيم التركيز المثبط االدنى baumannii 104 ( Mastoparan ) الى 69 مايكروغ ارم القيم لببتيد بينما الى 24 للببتيدات ( مايكروغ ارم الشكل )4-8( يبين للببتيدات ضد الفعالية معدل العشرين عزلة المقاومة و )136 MY1 الحساسة لمضاد Colistin للببتيد نشاط كان أعلى مقارنة بالببتيدات االخرى المصممة فضال عن ببتيد السيطرة قراءات معدل الفعالية للببتيدات ضد العزالت المقاومة الحساسة لمضاد و الشكل )4-8(: Colistin وكذلك اظهرت النتائج اختالف في نسبة تثبيط الخاليا البكتريا عند مختلف التر اكيز الجدول المئوية النسبة لتثبيط الببتيدات للعزلة رقم واحد التي أستخدمت كنموذج لعرض )8-4( يبين وبقية نتائج العزالت النتائج الموضحة في ملحق )3( إذ ارتفعت نسبة تثبيط الببتيدات MY1 كانت المصممة لخاليا البكتريا مقارنة Mastoparan أعلى نسبة تثبيط للببتيد ) إذ اظهر قدرة على حد من كثافة نمو البكتريا عند ت ر اكيز منخفضة تصل الى )05 مايكروغ ارم و تظهر االشكال )4-10( )4-11( )4-12( )4-13( )4-14( امتصاصية عند MY2, MY1 MY4, MY3 طول موجي 600 عند نانومير الت اركيز مختلقة من الببتيدات و Mastoparan على التوالي في اختبار فحص الحساسية للعزلة رقم واحد ايضا

84 الفصل الرابع النتائج والمناقشة جدول) 4-8 (: النسبة المئوية لتثبيط الببتيدات لنمو للعزلة رقم واحد الشكل )4-9( : تأثير تراكيز مختلقة من الببتيد MY1 للعزلة رقم واحد

85 الفصل الرابع النتائج والمناقشة تأثير تراكيز مختلقة من الببتيد MY2 للعزلة رقم واحد الشكل )4-10( : تأثير تراكيز مختلقة من الببتيد MY3 للعزلة رقم واحد الشكل )4-11( :

86 الفصل الرابع النتائج والمناقشة تأثير تراكيز مختلقة من الببتيد MY4 للعزلة رقم واحد الشكل )4-12( : تأثير تراكيز مختلقة من الببتيد Mastoparan للعزلة رقم واحد الشكل )4-13( : السبب وقد يعود في فرق الفعالية عموما بين الببتيدات المصممة و Mastoparan الى صافي الذي الشحنة تملكه الببتيدات MY4 والتي لها دور مهم في MY3 MY2 MY1-66 -

87 الفصل الرابع النتائج والمناقشة ذو البكتريا اغشية مع تداخلها الشحنة سالبة اشارت إذ الد ارسات الى دور زيادة الشحنة في )Glukhov استهداف الخاليا وتحديد )2005 al, et الخاليا المستهدفة نوع تمتاز Mastoparan الببتيدات المصممة بارتفاع نسبة مقارنة مع ببتيد التقابلية الصفة ومن MY1 ناحية اخرى اظهرت النتائج ارتفاع فعالية الببتيد مقارنة مع بقية الببتيدات المصممة إذ امتاز بارتفاع الك ارهية مع للماء تقارب في الخصائص االخرى بين الببتيدات المصممة من ناحية الشحنة والصفة التقابلية وبنية الحلزون وهذا ما يؤكد دور ك ارهية للماء في زيادة فعالية الببتيدات المضادة للميكربات كما في الشكل )4-15( الشكل )4-14( : عالقة ك ارهية للماء بفعالية الببتيدات المضادة للميكربات التربتوفان )W( والببتيدات المصممة تحتوي على حامض اميني واالرجنين )R( ضمن هيكلها Mastoparan البنائي وبالمقابل ال يوجد اي من الحامضين ضمن تواليات إذ اشارة الد ارسات et al, 2006( الى اهمية الترتوفان في تحسين فعالية الببتيدات في التداخل مع اغشية البكتريا اشارت ايضا al, )2007( Liu et الى ان الببتيدات القصيرة وبصفة )David و تقابلية وضمن توالياتها حامض االميني االرجنين )R( والتربتوفان ( W( لها نشاط أمثل ضد الميكروبات ويمتاز باحتوائه على حامض اميني االرجنين )R( إلضفاء MY1-67 -

88 الفصل الرابع النتائج والمناقشة )R( واالرجنين )K( اما بقية موجبة الشحنة احتوت على الببتيدات الاليسين مع وجود التربتوفان بنسب متفاوتة في الببتيدات مما رجح فرق الفعالية كما موضح في الشكل )4-16( جميع نسبة االحماض االمينية في الببتيدات موضحة في ملحق )4( الشكل )4-15( : عالقة الفعالية بمحتوى الببتيدات من الحامضين االرجنين )R( والتربتوفان ( W( )R( واالرجنين )K( )R( ان خصاص المجاميع الجانبية الفعالية مع وجود التربتوفان لحامض الاليسين إذ ان األرجينين لديه مجموعة لعبت ا دور Guanidinium في زيادة مهما التي تسمح بشحنة موجبة أكثر انتشار وتمنح توجيه أكبر إمكانية نحو انشاء اواصر هيدروجينية والشكل شبكة الهيدروجين على سطح الببتيدات المصممة كما ان )4-17( يوضح خصائص المجموعة الجانبية لألرجينين تسمح الموجودة في األحادية الاليسين )K( بالمشاركة بالتفاعالت المتعددة والشحنة الموجبة من االرجنين للشحنة خالفا توفر فعالية جذب الببتيدات إلى األغشية المستهدفة وال اربطة الهيدروجينية تسهل تفاعلها مع السطح سالبة الشحنة ) Biljana and Havard,2015 ( مثل LPS

89 الفصل الرابع النتائج والمناقشة ) π-electron systems ( π وهناك عامل مهم آخر هو نظام اإللكترون وفي المجموعة الجانبية حلقة اإلندول في التربتوفان يؤدي إلى ظهور سحب سالبة يمكن تتداخل مع الغشاء ان باإلضافة إلى ذلك يمكن األرجينين أيضا المجموعة مع التداخل )Aliste etal,2003( الجانبية التربتوفان اي تداخل السحابة االلكترونية للمجموعتين الجانبيتين والتربتوفان يمثل أكثر األحماض األمينية مالئمة لتمكين الببتيدات لمدة التداخل من طويلة مع الغشاء ويبدو أن )Jing etal,2003 ( التداخالت بين والتربتوفان واالرجنتين تسمح الخت ارق أعمق في غشاء ف ن وعموما الطبيعة الموجبة وال اربطة الهيدروجينية فريدة من نوعها لالرجنيين وخصائص التربتوفان تكمل بعضها البعض بشكل جيد لمنح فعالية اكبر للببتيدات المضادة للميكروبات الشكل )4-16(: شبكة الهيدروجين على سطح الببتيدات المصممة و Mastoparan

90 الفصل الرابع النتائج والمناقشة يمثل اللون االبنفسجي الجزء مانح في الشكل لجزئية الهيدروجين اما اللون االخضر فيمثل الجزء المستقبل للهيدروجين في تكوين االصرة الهيدروجنية يحوي كما الشكل قيم شبكة الهيدروجين التي تم الحصول عليها باستخدام الب ارمج الحاسوبية إذ اظهرت النتائج ارتفاع شبكة )057 ( الهيدروجين للببتيدات المصممة مقارنة ببتيد Mastoparan بلغت التي 6-4 حل فعالية الدم (HC50( Hemolytic Activity يستخدم انحالل خاليا الدم الحمر لإلنسان لتقييم الببتيدات سمية للخاليا الطبيعية وقد تم اختبار انحالل الدم للجميع الببتيدات المصممة و Mastoparan بتوحيد جميع ظروف )4-18( التجربة من ناحية مصدر الدم ووقت التعرض وتركيز الببتيدات يظهر الشكل مقارنة بين النشاط االنحاللي للببتيدات تم إذ تحديد ميل الببتيدات لتحليل نصف عدد الخاليا الدم برسم نسبة تحلل الدم مقابل تركيز الببتيدات

91 الفصل الرابع النتائج والمناقشة MY1 الدم انحالل فعالية (HC50) Hemolytic Activity للببتيدات شكل )4-17(: Mastoparan MY4 MY3 MY2 MY2-71 -

92 الفصل الرابع النتائج والمناقشة اشارت الد ارسات الى وجود العديد من االمتغي ارت تؤثر في نتائج تحلل الدم مثل مصدر خاليا الدم الحمر والتركيز ووقت التعرض للببتيدات ففي حالة استخدام دم االنسان يجب حضن Ziqing( C 37º الببتيدات مع الخاليا الدم الحمر لمدة 18 ساعة عند درجة ح اررة )et al, 2014 %50 من HC50 في الشكل )4-18( يمثل تركيز الببتيد )مايكروغ ارم( الذي ينتج عنه تحلل ) ( HC50 خاليا الدم اظهرت النتائج قيم بمقدار للببتيدات اما Mastoparan MY4 MY3 MY2 مايكروغ ارم MY1 من لكل على التوالي بلغت 80 مايكروغ ارم ومن الواضح انخفاض تحلل الدم للببتيدات المصممة مقارنة مع Mastoparan وقد يعود الى انخاض الك ارهية للماء للببتيدات المصممة اضافة الى الخصائص الفيزيوكيمياوية االخرى التي تم م ارعاتها اثناء تصميم الببتيدات مثل ال ازوية القطبية الكبيرة نسبيا والشحنة الموجبة العالية التي تملكها الببتيدات المصممة وبنية الحلزون بصفة تقابلية معتدلة نسبيا أثبتت الد ارسات الحديثة هناك أن عوامل متعددة بما في ذلك الشحنة الموجبة ال ازوية القطبية والك ارهية للماء وبنية الحلزون وغيرها التي يجب أن تكون في توازن أمثل حالة )Yin et al, 2012( للحصول على ببتيدات فعالة مع انخفاض النشاط تحلل الدم لتدرج القيم ان HC50 بين الببتيدات المصممة داللة على تأثير الك ارهية للماء حل في ) خاليا الدم نظ ار لتدرج قيم الك ارهية للماء بين تلك الببتيدات 19-4 )الشكل اشارت العديد وقد من الد ارسات الى تأثير الببتيدات كفاءة في ك ارهية الماء وخصوصا الببتيدات ذات حلزون بنية ألفا فاذا كانت الك ارهية للماء اعلى من المستويات المثلى سوف ينخفض نشاط الببتيد وتزداد ) Pasupuleti et al, 2012 السمية الخلوية (

93 الفصل الرابع النتائج والمناقشة الشكل )4-18(: العالقة بين ك ارهية الماء وفعالية حل الدم (HC50( Therapeutic Index 7-4 مؤشر العالجي )TI( مؤشر أو مفهوم وهو مقبول على نطاق واسع لتمثيل خصوصية الببتيدات المضادة للمكروبات باستهداف خاليا بداية النواة مقابل خاليا حقيقية النواة وهو تركيز بين يمثل نسبة الببتيد المسبب لتحلل نصف خاليا الدم الحمر ( (HC50 الى التركيز المثبط االدنى تستهدف الخاليا بدائية النواة ( al, Ziqing et القيم العالية إذ تشير الى ان الببتيدات )MIC ( الشكل مؤشر العالجية يبين للببتيدات المصممة وقد تم حساب مؤشر )4-20( )2014 A العالجية المختبري التركيز معدل باستخدام المثبط االدنى لعشرين عزلة من بكتريا التي تم حساب لها في فحص فعالية الببتيدات المصممة تم قياس وكذلك MIC baumannii للببتيدات او المتوقع الحاسوبسي بأستخدام الب ارمج المصممة وفق خوارزميات بأمكانها التنبؤ TI بمؤشر العالجية

94 الفصل الرابع النتائج والمناقشة الشكل )4-19(: المؤشرات العالجية )I T( المتوفع والمختبري للببتيدات المصممة اظهرت النتائج بشكل عام المختبرية ارتفاع االنتقائية للببتيدات المصممة نحو خاليا بدائية النواة الببتيد انتقائية ان إذ للج ارثيم دون خاليا المضيف مفهوم يتوافق مع دورها في المناعة الفطرية وتعد سمية الخاليا عقبة رئيسة في تطوير ودخولها في الببتيدات مجال )2013( Nada et al AMPs التطبيقات الطبية وهي من المعاير الرئيسة في تقيم كما اشار ان التحدي عند تصميم ببتيدات فعالة في االغشية بمؤشر عالجي مناسب هو ضمان النشاط, المضاد للبكتريا يكون مقبول مع تجنب السمية الخلوية غير المقبولة للخاليا المضيفة )2009 ) Katsumi TI ولا شكال )4-20( نتائج بين التباين يوضح المختبرية والمتوقعة اظهرت النتائج إذ المختبرية ارتفاع MY1 ببتيد انتقائية مقارنة ببقية الببتيدات بينما توقعت الب ارمج ارتفاع في MY2 MY3 انتقائية MY4 و وكذلك انخفاض حاد في بينما اظهرت النتائج المختبرية تقارب )4-22( )4-21( MY3 بين كل من MY2 و االشكال توضح كما التباين بين موشر العالجية المتوقع والمختبري بالمقارنة مع بعض الخصائص )23-4( الفيزيوكيمياوية ان اسلوب التصميم عن طريق استخدام الب ارمج يسهل التصميم ويقلل كلفة تصنيع الببتيد واختباره فعلى الرغم من دور الب ارمج في المساعدة في التصميم قد تفتقر

95 الفصل الرابع النتائج والمناقشة أحيا نا الى الدقة في توقع بعض الخصائص ان إذ األداء الفعلي للتصاميم يحكم عليه بالتحقيق تجريبيا الشكل )4-20( : تباين النتائج ( )TI المختبرية والمتوقعة والعالقة مع طول الببتيدات المصممة الشكل )4-21( : تباين النتائج ( TI ) المختبرية والمتوقعة والعالقة مع الكراهية للماء الببتيدات المصممة

96 الفصل الرابع النتائج والمناقشة الشكل )4-22( : تباين النتائج ( TI ) المختبرية والمتوقعة والعالقة مع الصفة التقابلية الببتيدات المصممة ان د ارسة عالقة مؤشر العالجية )TI( مع مواصفات الببتيدات تشير وان كان بشكل غير مباشر الى ان بعض الصفات تكون فاعلة في هذا المجال واالخرى غير واضحة المعالم فطول الببتيد ال يكون مؤث ار بشكل فاعل كما يشير الشكل 21-4 الى عالقات موجبة او سالبة متكافئة تقريبا 0579( ولكن ك ارهية الماء هي المؤثر االكبر )شكل 22-4( ومختبري )متوقع + اذ كان االرتباط النظري لهذه الصفة مع TI عالي جدا )091( اذ ان للببتيد درجة ك ارهية للماء عالية وقد اشار االرتبط العملي او لمختبري الى ارتباط )0579( والذي ال ي ازل مهما وهذا يشير بدوره الى ان الحسابات النظرية ال تنطبق تماما على النتائج العملية نظ ار لكون االنظمة الحيوية فيها الكثير من المؤث ارت التي تخلو منها الحسابات النظرية كما يظهر بالنسبة للببتيد في الشكل 23-4 وهذا يتفق مع التوجهات الصحيحة حول تصميم االدوية والببتيدات MY1 اذ ال يكتفى بد ارسات الحاسوب سواء للسمية او االنتقائية او االمتصاص وغيرها والبد ان تمر على مرشحات عملية مثل م ازرع الخاليا والحيوانات المختبرية ومتبرعين الق اررها قبل طرحها لالستعمال لتبيان الواقع الحيوي وليس الواقع الحاسوبي ولهذا يالحظ طول المدة التي يستغرقها طرح منتج جديد لالسواق ولكن في االونة االخيرة ساعد الحاسوب وب ارمجه من تقليص المدة من عقود من السنين الى مدة قصيرة جدا

97 االستنتاجات والتوصيات

98 Summary Summary The growing resistance of Acinetobacter baumannii and other microorganisms to various antibiotics worldwide pushed towards the search for new antibiotics and drugs The natural antimicrobial peptides (AMPs) exhibit wide array of antimicrobial activities and since then have been the focus in development as alternative therapeutics In this study, four peptides (MY1, MY2, MY3MY4) were designed and tested against A baumannii, imposed a template within the general standards of (AMPs) and using many databases to predict their effectiveness Designed peptides lengths ranged between (11 to 14) amino acids with net positive charge between (6+ to 7+) A baumannii was isolated from 75 samples from wound, urine, sputum, and blood, which were collected from Baghdad hospital / Medical city, Ibn Al balady Hospital, Al Yarmouk Teaching Hospital and Child Protection Teaching Hospital Fifty isolates (6666 %) of A baumannii was identified depending on the morphological and biochemical tests, and using API 20E system Isolates distribution of A baumannii samples (blood,wound, urine and sputum ) were (30, 26, 12, 12) % respectively The susceptibility of A baumannii isolates to 8 antibiotics were performed 80% of isolates were susceptible to colistin and resistant to Trimethoprimsulfamethoxazole, Tetracyclin, Meropenem, Amikacin, Ciprofloxacin, Cefotaxime and Piperacillin I

99 ) 66,78,84,86,90,92,94( % Results showed that colistin is the most effective compared to other antibiotics in the treatment of infection Abaumannii Minimum inhibitory concentration ( MIC) of deasigned peptides were determined by apply on isolated Abaumannii, generally designed peptides showed effective in reducing the growth of bacteria The minimum inhibitory concentration of peptides values between (24 to 69) µg Assess toxicity of AMPs to the host cells, were measuring the Hemolytic Activity (HC50) the results, that revealed HC50 of peptides values were (380, 440, 500, 560 ) μg (MY1, MY2, MY3, MY4) respectively Therapeutic index, the results showed specific activity of antimicrobial peptide towards prokaryotic cells compared to eukaryotic cells, the values (TI) were (12258, 7096, 7299, 8615) for each (MY1, MY2, MY4, MY4) respectively

100 المصادر

101 References المصادر / الخفاجي سيناء مهدي شاكر )2006( د ارسة عن كبسولة بكتريا Acinetobacter baumannii وتأثيرها على االستجابة المناعية أطروحة دكتو اره كلية العلوم الجامعة المستنصرية الع ارق المحنة عباس شاكر جواد )2006( د ارسة جزيئية وو ارثية لعوامل الض اروة لبكتريا Acinetobacterالمعزولة من خمجات مرضية مختلفة اطروحة دكتو اره كلية العلوم الجامعة المستنصرية الع ارق مسافر هديل كريم )2007( تأثير عوامل اإللتصاق لبكتيريا Acinetobacter baumannii على السطوح الحية وغير الحية رسالة ماجستير كلية العلوم الجامعة المستنصرية المشهداني إيناس إب ارهيم جاسم )2010( د ارسة فعالية البكتريوسين المنتج من قبل بكتريا Lactobacillus plantarum في عوامل الض اروة لبكتيريا Acinetobacter baumanniiرسالة ماجستير كلية العلوم الجامعة المستنصرية الع ارق عبد الكريم أف ارح فهد )2008( د ارسة مقاومة مضادات الحياة وبعض عوامل فياعة بكتيريا Acinetobacterالمعزولة baumannii من اإلد ارر رسالة ماجستير كلية العلوم الجامعة المستنصرية الع ارق

102 References المصادر / Abdel- El- Haleem, D 2003 Acinetobacter environmental and biotechn-ological applications African Journal of Biotechnology, 2 : Adam, A, Strömstedt, Lovisa,R, Artur Sand Martin,M 2010Interaction between amphiphilic peptides and phospholipid membranes, Urrent Opinion in Colloid and Interface Science, 15: Al Sehlawi, Z, Almohana, A and Al Thahab, A 2014 Isolation and identification of Acinetobacter baumannii clinical isolates using novel methods Journal Babylon University, 3 : Al-Ajeeli,E 2013 Molecular study of extended spectrum β-lactamases and metallo β- Lactamases Produced by clinical isolates of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa PhDThesis College of ScienceALkufa University Iraq Al-Hamadani,A, Al-Mohana, A and Al-Khazaali A 2014 Emergence of plasmid mediated aac(6 )-Ib-cr gene in flouroquinolon- resistant Acinetobacter spp Qatar Medical Journal,10 : Aliste, M, MacCallum,L, Tieleman, D 2003 Molecular dynamics simulations of pentapeptides at interfaces: salt bridge and cation pi interactions Biochemistry, 42 : Al-Warid, R 2014 Immunological and molecular Study on Acinetobacter baumannii isolated from clinical samples PhD Thesis University of Babylon,Iraq Anone 1993 British Pharmacopia Vol 1 Printed in the U K Anton,Y, Harald,S and David, L 2008 Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen Journal of Clinical Microbiology, 21,: Antunes,L, Imperi,F, Carattoli, A, Visca, P 2011 Deciphering the multifactorial nature of Acinetobacter baumannii Pathoge-nicity PLoS One,6:e22674 A

103 References المصادر / Aoife,H, Michael, D, Audrey, F and Roy,D Sleator 2012 Acinetobacter baumannii an emerging opportunistic pathogen Virulence, 3 : B Baron, E, Lancer,R and Sydney, M 1994 Dignostic microbiology,10th ed Balley and Scotts Mosby Co Baltimor, Boston Benson, H 2002Microbiological application : Laboratory manual in general microbiology, 8 th ed McGraw Hill Co, Inc,New York Bergonge-Berezin, E and Towner, K 1996 Acinetobacter SPP As nosocomial pathogen: microbiological, clinical and epidemiological features Journal of Clinical Microbiology, 9: Bessalle, R, Haas, H, Goria, A, Shalit, I and Fridkin, M 1992 Augmentation of the antibacterial activity of magainin by positive-charge chain extension Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 36: Biljana,M and Håvard,J 2015 Peptides and peptidomimetics for antimicrobial drug design Pharmaceuticals, 8 : Bishburg, E and Bishburg, K 2009 Minocycline an old drug for a new century: emphasis on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Acinetobacter baumannii International Journal of Antimicrobial Agents, 34 : Boniotto, M, Antcheva, N, Zelezetsky, I, Tossi, A, Palumbo, V, Verga F, et al 2003 A study of host defence peptide beta-defensin 3 in primates Biochemical Journal, 374: Boulanger, A, Nass, T, Fortineau, N,Figueiredo, S and Nordmann, P 2012 NDM-1- producing Acinetobacter baumannii from algeria Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 56 : Boyce,J and Alder, B 2000 The capsule is a virulence determinant in the pathogenesis of Pasteurella multicida M1404(B:2) Infection and Immunity,68:

104 References المصادر / Brisse, S, Milatovic, D, Fluit,AC, Kusters,K, Toelstra,A, Verhoef,J and Schmitz, F 2000Molecular surveillance of european quinolone resistant clinical isolates of pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp Using automated ribotyping Journal of Clinical Microbiology, 38: Brogden, K 2005 Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nature Reviews Microbiology, 3 : Brooks, G, Butel, Jand Mors, S 2007 Jawtz,Melnck and Adelberg's medical microbiology 24 th edmcgraw-hillnew Brown, A 2005 Microbiological Applications Laboratory manual in general microbiology McGraw-Hill New York C Cheesbrough, M 2012 District laboratory practice in tropical countries 2 nd edition update (part 2), Cambridge university press: India Cho,Y, Moon, D C, Jin, J S, Choi, CH, Lee, Y C, and Lee, J C 2009 Genetic basis of resistance to aminoglycosides in Acinetobacter spp and spread of arma in Acinetobacter baumannii sequence group 1 in Korean hospitals Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 64: Christine,C, Viviane,S, Catherine,M and Pascal,S 2011 Antibacterial Peptides: A Review Formatex, Christopher,D, Jan, A, Robert,E and Gisbert,S 2012 Designing antimicrobial peptides: form follows function Nature Reviews Drug Discovery, 11: CLSI, (Clinical and Laboratory Standards Institute) 2011 Performance standard for antimicrobial susceptibility testing,twenty-first informational supplementm100- S2131 Collee, J, Fraser, A, Marmion, B and Simmons, A 1996 Practical medical microbiology 14th ed Churchill Livingstone - New York

105 References المصادر / Constantiniu, S, Romaniuc, A, Iancu, L and Tarasi, I 2004 Cultural and biochemical characteristics of Acinetobacter spp strains isolated from hospital units The Journal of Preventive Medicine, 12:35-42 Crosa, J 1989 Genetics and molecular biology of siderophore-mediated iron transport in bacteria Microbiological Reviews,53: Cruickshank,R, Duguid,JP,Mormion,BP and Swain,RH 1975 Medical microbiology Vol 2, 12 th ed Edinburgh Churchil Livingstone Cudic, M and Otvos,L 2002 Intracellular targets of antibacterial peptides Current Drug Targets,3: D Dathe, M, Nikolenko,H, Meyer, J, Beyermann, M and Bienert,M 2001Optimization of the antimicrobial activity of magainin peptides by modification of charge FEBS Letters,501: David, I, Elmar, J and Hans J 2006 Tryptophan- and arginine-rich antimicrobial peptides: Structures and mechanisms of action Biochimica et Biophysica Acta, Dennison, S, Harris,Fand Phoenix,D 2005 Are oblique orientated alpha-helices used by antimicrobial peptides for membrane invasion Protein and Peptide Letters,12:27-29 Dijkshoorn, L, Nemec, A and Carretto, E 2011 Acinetobacter baumannii, a troublesome guest in the hospital Giornale Italiano Multidisciplinare per la Prevenzione delle Infezioni nelle Organizzazioni Sanitarie, 1: Dijkshoorn, L,Nemec, Aand Seifert,H 2007 An increasing threat in hospitals: multidrugresistant Acinetobacter baumannii Nature Reviews Microbiolog,5: Doi, Y, and Arakawa, Y S ribosomal RNA methylation: emerging resistance mechanism against aminoglycosides Clinical Infectious Diseases, 45 :88-94 Donlan,R 2002Biofilms: microbial life on surfaces Emerging Infectious Diseases journal, 8:

106 References المصادر / Doughari,H, Ndakidemi, P, Human, I and Benade S 2011 The ecology, biology and pathogenesis of Acineobacter spp: An overview Microbes and Environments, 26: Dubos, R1939 Studies on a bactericidal agent extracted from a soil bacillus: I Preparation of the agent Its activity in vitro The Journal of Experimental Medicine, 70 :1 10 E Edward,G and Ralph, R 2015 Antibiotic modulation of capsular exopolysaccharide and virulence in Acinetobacter baumannii PLOS Pathogens, 11: e F Federico, M, Ruiz, E, Mercedes,S, Eva,T, Esther,C and Antonio,R 2015 Crystal structure of hcp from Acinetobacter baumannii: A component of the type VI secretion system PLoS One, 16;10 :e Fjell,C, Hiss,J, Hancock,Rand Schneider,G 2012 Designing antimicrobial peptides: form follows function Nature Reviews Drug Discovery, 11: Fluit, A, Florijn, A, Verhoef, J and Milatovic, D 2005 Presence of tetracycline resistance determinants and susceptibility to tigecycline and minocycline Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49 : Forbes, B, Saham, D and Weissfeld, A 2007 Diagnostic microbiology in bailey and scott's, 12 th ed, Mosby Elsevier G Gaddy,J, Tomaras, A, Actis,L 2009 The Acinetobacter baumannii Omp Aprotein plays a role in biofilm formation on abiotic surfaces and the interaction of this pathogen with eukaryotic cells Infection and Immunity,77: Gales, A, Reis,A and Jones, R 2001Contemporary assessment of antimicrobial susceptibility testing methods for polymyxin B and colistin: review of available interpretative criteria and quality control guidelines Journal of Clinical Microbiology,

107 References المصادر / Gautam, A, Chaudhary, K, Kumar, R, Sharma, A, Kapoor, P, Tyagi, A and Raghava, G 2015 Computer-Aided virtual screening and designing of cell-penetrating peptides Methods in Molecular Biology,1324:59-69 Gautam, A, Chaudhary, K, Kumar, R, Sharma, A, Kapoor, P, Tyagi,A, et al 2013 In silico approaches for designing highly effective cell Penetrating peptides, 11: 1-12 Giamarellou,H, Antoniadou, A and Kanellakopoulou, K 2008 Acinetobacter baumannii: a universal threat to public health? International Journal of Antimicrobial Agents, 32: Glukhov, E, Stark, M, Burrows, L and Deber,C 2005 Basis for selectivity of cationic antimicrobial peptides for bacterial versus mammalian membranes Journal of Biological Chemistry,280: Gohl,O, Friedrich, A, Hoppert, M and Averhoff,B2006 The thin pili of Acinetobacter sp strain BD413 mediate adhesion to biotic and abiotic surfaces Applied and Environmental Microbiology, 72: Goldman, E and Lorrence, H 2009 Practical Handbook of Microbiology Second edition Printed in the United States of America Gordon, N and Wareham,D 2010 "Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii: mechanisms of virulence and resistance" International Journal of Antimicrobial Agents, 35 : Gunn, J 2001 Bacterial modification of LPS and resistance to antimicrobial peptides Journal of Endotoxin Research, 7: Gupta, R 2011 Origin of diderm (Gram-negative) bacteria: antibiotic selection pressure rather than endosymbiosis likely led to the evolution of bacterial cells with two membranes Antonie van Leeuwenhoe, 100 : H

108 References المصادر / Hadi, M 2014 Isolation of Acinetobacter baumannii from different clinical source and Study some antibiotic resistant and β-lactamase Production Medical Journal of Babylon, 11 : Hale, J and Hancock, R 2007 Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria Expe Expert Review of Anti-infective Therapy, 5(6): Hammood, N, Jabbar,H and Arsheed, M 2013 Imipenem-resistant Acinetobacter baumannii isolated from patients and hospitals environment in Baghdad Iraqi Journal of Science, 54: Hancock,R and Patrzykat, A 2002 Clinical development of cationic antimicrobial peptides: from natural to novel antibiotics Current Drug Targets Infectious Disorders, 2: Hancock, R and Sahl, H 2006 Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies Nature Biotechnology, 24: Hargrave, P 2000 Selected bacteriological culture media In: Mahon, C and Manuselis, G (eds) Textbook of diagnostic microbiology 2 nd edition WB Sanders Company Higgins, P, Wisplinghoff, H, Stefanik, D and Seifert, H 2004 Selection of topoisomerase mutations and overexp-ression of adeb mrna transcripts during an outbreak of Acinetobacter baumannii Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 54: Holt, H, Krieg, N, Sneath,P, Statey,T and Williams, S 1994 Bergey's manual of determinative bacteriology 4 th ed Williams and Wilkins, Baltimore USA Hoskin, D W and Ramamoorthy, A 2008 Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides Biochimica et Biophysica Acta,2: I Ignasi, R, Paula,E, Xavier, V and Jordi,V 2012 The Acinetobacter baumannii oxymoron: commensal hospital dweller turned pan-drug-resistant menace Frontiers in Microbiology, 23:

109 References المصادر / Imrich, B and Katarína, M 2013 The role of lipid domains in bacterial cell processes International Journal of Molecular Sciences, J Jawad,A, Heritage,J, Snelling,A,Gascoyne Binzi,D and Hawkey,P 1996 Influence of relative humidity and suspending menstrual on survival of Acinetobacter spp On dry surfaces Journal of Clinical Microbiology, 34: Jia, X,Patrzykat, A, Devlin, R, Ackerman, P, Iwama, G and Hancock, R 2000 Antimicrobial peptides protect coho salmon from Vibrio anguillarum infections Applied and Environmental Microbiology,5 : Jin,Y, Hammer, J, Pate, M, Zhang,Y, Zhu,F, Zmuda, E and Blazyk,J 2005 Antimicrobial activities and structures of two linear cationic peptide families with various amphipathic beta-sheet and alpha-helical potentials Antimicrobial Agents and Chemotherapy,49: Jing,W, Demcoe, A, Vogel, H 2003 Conformation of a bactericidal domain of puroindoline a: structure and mechanism of action of a 13-residue antimicrobial peptide Journal of Bacteriology, 185: Joly-Guillou, M 2008 Nosocomial and community-acquired Acinetobacter infections Infectious Diseases and Pathogenesis, Joly-Guillou M 2005 Clinical impact and pathogenicity of Acinetobacter Clinical Microbiology and Infection, 11: Jones,R, Sader,H, Fritsche,Tand Rhomberg P 2006 Carbapenem susceptibility discords among Acinetobacter isolates Clinical Infectious Diseases, 42:158 Jenssen, H, P Hamill, Hancock, R 2006 "Peptide antimicrobial agents" Clin Microbiol Rev, 19: K Katsumi, M 2009 Control of cell selectivity of antimicrobial peptides Biochimica et Biophysica Acta,

110 References المصادر / Kaur, H, Garg, A and Raghava, G 2007 PEPstr: A denovo method for tertiary structure prediction of small bioactive peptides Protein and Peptide Letters Journa, 14: King, L, Swiatlo, E, Swiatlo, A and McDaniel, L 2009 Serum resistance and bioinformation in clinical isolates of Acineto-bacter baumannii FEMS Immunology and Medical Microbiology,55 : Koczulla, A and Bals, R 2003 Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential Drugs, 4: Kris, P, Daniel, E, Vanaja, P, Hector, C, Lizzette, G, Robert,B, et al 2007 In Vitro Activity of Colistin against Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacteria Isolated at a Major Army Hospital during the Military Campaigns in Iraq and Afghanistan Clinical Infectious Diseases, 45: L Laura, G, Egidia,M, Olivia, D, Codrina,B, Andra,T, Cătălina, L and Carmen, D 2014 Appropriate empirical and antibacterial therapy for severe infection with nonfermenters Romanian Journal of Oral Rehabilitation, 6 : Li, J, Nation, R, Turnidge, J, Milne, R, Coulthard, K, Rayner,C and Paterson,D 2006 Colistin: the re-emerging antibiotic for multidrug-resistant gram-negative bacterial infections Lancet Infectious Diseases, 6: Liang, W, Liu, X F, Huang, J, Zhu, D M, Li, J, and Zhang, J 2011 Activities of colistinand minocyclinebased combinations against extensive drug resistant Acinetobacter baumannii isolates from intensive care unit patients BMC Infectious Diseases, 10: Limansky, A, Mussi, M and Viale, A 2002 Loss of a 29-kilodalton outer membrane protein in Acinetobacter baumannii is associated with imipenem resistance Journal of Clinical Microbiology,40: Lisa, L and Trish,M 2008 Acinetobacter baumannii: Epidemiology, antimicrobial resistance, and treatment Options Clinical Infectious Diseases,46:

111 References المصادر / Liu, Z, Young, A, Hu, P, Rice, A, Zhou, C, Zhang, Y and Kallenbach, N 2007 Tuning the membrane selectivity of antimicrobial peptides by using multivalent design ChemBioChem, 8, M Maza, L, Pezzlo, M, Shigeni, J, Peterson, E 2004 Color Atlas of Medical bacteriology American Society for Microbiology (ASM)Washington Michael J, Luis, A and Jero, N 2013 Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models FEMS Microbiology Reviews, 37: Moffatt, J, Harper, M and Harrison, P 2010 Colistin resistance in Acinetobacter baumannii is mediated by complete loss oflipopolysaccharide production Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 54: Mohammed, H 2013 Physicochemical Factors Affected the Partial Purified Lipase Activity of Acinetobacter baumannii local isolates Iraqi Journal of Pharmaceutical Sciences, 22 : Monthon, L and Songtham,S 2008 Acomparison of two methods used for measuring the antagonistic activity of Bacillus spp ournal of Science and Technology,5: Morello, J, Mizer, H and Granato, P 2006 Laboratory manual and work book in microbiology8 th ed McGraw-Hill Higher Education New York Musafer, H and Essa,R 2013 Inhibition of Acinetobacter baumannii adhesion by antifimbrial antibody : the fimbrial antigen effectiveness Mintage journal of pharmaceutical and medical sciences, 2 : N Nada,I, Mario, N, Filomena, G, Daniela,X, Monica, B, Alessandro,T and Davor, J 2013 Selective antimicrobial activity and mode of action of adepantins, glycinerich peptide antibiotics based on anuran antimicrobial peptide sequences Biochimica et Biophysica Acta,1828 :

112 References المصادر / Nahaie, M, Goodfellow,M, Minnikin,D, Hájek V 1984 Polar lipid and isoprenoid quinone composition in the classification of staphylococcus Journal of general microbiology, 130 : Nassar,R Lafi, M and Salman,S 2013 The incidence of pan-drug resistance in a sample of Acinetobacter baumannii clinical isolates obtained from Al-Ramadi Teaching Hospital Iraqi Journal of Science, 3 : Nguyen, L, Chau,J, Perry, N, de Boer L, Zaat,S and Vogel,H 2010 Serum stabilities of short tryptophan- and arginine-rich antimicrobial peptide analogs PLoS One,5:e12684 Nguyen, L ; Haney, E and Vogel, H 2011 The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action Trends in Biotechnology, 29 : Nishikata, M, Kanehira,T, Oh,H, Tani, H, Tazaki,M,Kuboki, Y 1991 Salivary histatin as an inhibitor of a protease produced by the oral bacterium Bacteroides gingivalis Biochemical and Biophysical Research Communications,174: Nizet, V 2006 Antimicrobial peptide resistance mechanisms of human bacterial pathogenes Current Issues in Molecular Biology, 8: O Oren, Z and Shai, Y 1998 Mode of action of linear amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides Biopolymers, 47 : P Pace,C and Scholtz J 1998 A helix propensity scale based on experimental studies of peptides and proteins Biophysical Journalm,75: Pasupuleti, M, Schmidtchen, A and Malmsten, M 2012 Antimicrobial peptides: key components of the innate immune system Critical Reviews in Biotechnology, 32 :1-29 Pasupuleti, M, Walse,B, Svensson, B, Malmsten, Mand Schmidtchen,A 2008 Rational design of antimicrobial C3a analogues with enhanced effects against Staphylococci

113 References المصادر / using an integrated structure and function-based approach Biochemistry,47: Peleg, A, Seifert, H and Paterson, D 2008 Acinetobacter baumannii: Emergence of a successful pathogen Clinical Microbiology Reviews, 21 : Peschel, A 2002 How do bacteria resist human antimicrobial peptides? Trends in Microbiology, 10 : Peters,B, Shirtliff, M, Jabra-Rizk M 2010 Antimicrobial Peptides: Primeval Molecules or Future Drugs? PLoS Pathogens, 6 : e Peymani, A, Farajnia, S,Nahaei, M, Sohrabi, N, Abbasi, L,Ansarin, K and Azhari, F 2012 Prevalence of Class 1 Integron Among Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii in tabriz, northwest of Iran Polish Journal of Microbiology, 61 : Prashanth, K and Badrinath, S 2004 In vitro susceptibility pattern of Acinetobacter species to commonly used cephalosporins, quinolones, and aminoglycosides Indian Journal of Medical Microbiology, 22 : Qureshi,Z, Hittle,L, O'Hara,J, Rivera,J, Syed, A, Shields,R, et al 2015 Colistinresistant Acinetobacter baumannii : beyond carbapenem resistance Clinical Infectious Diseases, 1: Q R Radek,K and Gallo, R2007 Antimicrobial peptides: Natural effectors of the innate immune system Seminars in Immunopathology,29 :27 43 Rahbar, M, Rasooli,I,Gargari,S, Amani,J,Fattahian,Y 2010 silico analysis of antibody triggering biofim associated protein in Acinetobacter baumannii Journal of Theoretical Biology,266:

114 References المصادر / Ribera, A, Ruiz,J and Vila,J 2003 Presence of the Tet M determinant ina clinical isolate of Acinetobacter baumannii Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47: Rodrigo,E, Thomas, R, Helio,Sand Ronald, N 2008 Increased Antimicrobial susceptibility profiles among polymyxin-resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates Clinical Infectious Diseases, 46 : Russo,T, Luke, N, Beanan, J, Olson, R, Sauberan,S, MacDonald,U, et al 2010 The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain is a major virulence factor Infection and Immunity, 78: Ryan,L, Lamarre, B, Diu,T, Ravi,J, Judge,P, Temple,, et al 2013 Anti-antimicrobial peptides: Folding-mediated host defense antagonists The Journal of Biological Chemistry,288: S Salomon, R and Farias, R 1992 Microcin 25, a novel antimicrobial peptide produced by Escherichia coli Journal of Bacteriology, 174 : Scott,P, Deye,G, Srinivasan,A, Murray,C, Moran,K, Hulten, E, et al 2007 An outbreak of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex infection in the US military health care system associated with military operations in Iraq Clinical Infectious Diseases, 15: Shin,J, Chang,Y, Kim, H, Kim,S, Chang,J, Ahn C and, Byun, M 2012 Clinical outcomes of tigecycline in the treatment of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection Yonsei Medical Journal, 53: Skaar, E 2010 The battle for iron between bacterial pathogens and their vertebrate hosts PLOS Pathogens,6 :e Smith, C, and Baker, E 2002 Aminoglycoside antibiotic resistance by enzymatic deactivation Curr Drug Targets Infect Disord, 2: Spitznagel, J and Zeya, H 1966 Cationic proteins of polymorpho-nuclear leukocyte lysosomes Journal of Bacteriology, 91:

115 References المصادر / Strong, W, LEA,D and WARD, D 1978 Measurement of total haemolytic complement activity in body fluids Journal of Clinical Pathology, 31: Sudheer,G, Pallavi,K, Kumardeep,C, Ankur,G, Rahul,K and Gajendra, R 2013 In Silico approach for predicting toxicity of peptides and proteins PLoS One, 13:e73957 T Thomson, J and Bonomo, R 2005 The threat of antibiotic resistance in gram-negative pathogenic bacteria: beta-lactams in peril! Current Opinion in Microbiology, 8: Tossi, A,Sandri, L and Giangaspero, A 2000 Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides Biopolymers, 55 :4-30 U Urban, C, Go,E, Mariano,N, Berger,B, Avraham,I and Rubin D 1993 Effect of sulbactam on infections caused by imipenem resistant Acinet-obactercalcoaceticus biotype anitratus Journal of Infectious Diseases, 167 : V Vila, J and Pachon, J 2012 Therapeutic options for Acinetobacter baumannii infections: an update Expert Opinion on Pharmacotherapy, 13: Vila, X, Garcia,C, Lopez,R, Pacho, J, Giralt,E and Vila,J 2012 In vitro activity of several antimicrobial peptides against colistinsusceptible and colistin-resistant Acinetobacter baumannii Clinical Microbiology and Infection, 18: Velkov,T, Soon, R, Chong,P, Huang,J, Cooper, M, Azad,M, et al 2013 Molecular basis for the increased polymyxin susceptibility of Klebsiella pneumoniae strains with under-acylated lipid A Innate Immunity, 19:

116 References المصادر / W Waghu,F, Barai,R, Gurung,P and Idicula-Thomas,S 2015 CAMPR3: a database on sequences, structures and signatures of antimicrobial peptides Nucleic Acids Research, 44: Wareham, D, Gordon, N and Hornsey, M 2011 In vitro activity of teicoplanin combined with colistin versus multidrug-resistant strains of Acinetobacter baumannii Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 66: WHO, (World Health Organization) 2003 Basic laboratory procedures in clinical bacteriology 2 nd ed Geneva, Switzerland X Xin,Y, Bakhtiar,A and Shahriza,S 2015 Prediction of Antimicrobial Peptides Based on Sequence Alignment and Support Vector Machine-Pairwise Algorithm Utilizing LZ- Complexity BioMed Research International, 2015 : 1-13 Y Yang, L,Harroun, T, Weiss, T, Ding, L and Huang, H 2001 Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores Biophysical Journal, 81: Yeaman, M and Yount, N 2003 Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance Pharmacological Reviews, 55 : Yin, L, Edwards, M, Li, J, Yip, Cand Deber, C 2012 Roles of hydrophobicity and charge distribution of cationic antimicrobial peptides in peptide-membrane interactions Journal of Biological Chemistry, 287: Yount,N, Bayer,A, Xiong,Yand Yeaman, M 2006 Advances in antimicrobial peptide immunobiology Biopoly,84: Yount, N and Yeaman, M 2004 Multidimensional signatures in antimicrobial peptides Proceedings of the National Academy of Sciences U S A, 101:

117 References المصادر / Yu-Chung, C, Chien-Yu,C, Wang-Huei,S, Hsin-Yun,S, Jann-Tay,W, Yee-Chun, et al 2014 Effectiveness of tigecycline-based versus colistin- based therapy for treatment of pneumonia caused by multidrug- resistant Acinetobacter baumannii in a critical setting: a matched cohort analysis BMC Infectious Diseases, 24: Yun,C, Dong, C, Rui,W, Beibei,L and Nan, B 2012 Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 67 : Z Zasloff, M 2002Antimicrobial peptides of multicellular organisms, Nature journal, 415: Ziqing,J, Adriana, I, Michael,L and Robert,S 2014 Specificity Determinants Improve therapeutic indices of two antimicrobial peptides piscidin 1 and dermaseptin S4 against the gram-negative Pathogens Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa Pharmaceutical, 7:

118 المالحق

119 المالحق AMPs ملحق ( )2 المكتبة المستعملة لرسم صورة شاملة عن التي تستهدف البكتريا سالبة لصبغة الغرام PI ال توال ي ال طو ل صاف ي ال شحنة ال كراه يةلل ماء اAmphipathicity االخ تراق ية )SVM( ال سمية )SVM( ال تركيب ال وزن ال جزئي ي محتوى الهيدروجي ن Unknown AGFVLKGYTKTSQ Helix ALWMTLKKKVLKAAAKALNAVLVGANA Unknown FFPIGVFCKIFKTC Unknown FFPIVAGVAGQVLKKIYCTISKKC Helix FFPLALLCKVFKKC Unknown FIITGLVRGLTKLF Unknown FLPFIARLAAKVFPSIICSVTKKC Unknown FLSAIASMLGKFL Unknown FWGKLWEGVKNAI Beta GCRFCCNCCPNMSGCGVCCRF Helix GIGAAILSAGKSALKGLAKGLAEHF Helix GIGAAILSAGKSIIKGLANGLAEHF Helix GIGASILSAGKSALKGLAKGLAEHFAN

120 المالحق PI التوال ي ال طو ل صاف ي ال شحنة ال كراه يةلل ماء اAmphipathicity االخ تراق ية )SVM( ال سمية )SVM( التركيب ال وزن ال جزئي ي محتوى الهيدروجي ن Helix GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ Unknown GIGKFLHSAGKFGKAFLGEVMKS Helix GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS Unknown GLKKLLGKLLKKLGKLLLK Unknown GLVDVLGKVGGLIKKLLPG Rich GNNRPIYIPQPRPPHPRL Rich GNNRPVYIPQPRPPHPRI Rich GNNRPVYIPQPRPPHPRL Rich GRPNPVNNKPTPHPRL Rich GRPNPVNTKPTPYPRL Helix INLKALAALAKKIL Unknown KIIFLIAI

121 المالحق PI التوال ي ال طو ل صاف ي ال شحنة ال كراه يةللماء اAmphipathicity االخ تراق ية )SVM( ال سمية )SVM( التركيب الوزن ال جزئي ي محتوى الهيدروجي ن Helix KLALKLALKALKAALKLA Helix KRIVQRIKDFLR nonalphabeta KTKKKLLKKT Helix LPWKWPWWPWRR Unknown LRPAILVRIK Unknown NRWCFAGDD Rich QRFIHPTYRPPPQPRRPVIMRA Helix RWWRWWRRWWRR UBeta TWLKKRRWKKAKPP Unknown VIVKAIATLSKKLL

122 Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research University of Baghdad Genetic Engineering and Biotechnology Institute Design and Using of Antimicrobial Peptides Against Antibiotic Resistant Acinetobacter baumannii A Thesis Submitted to the Council of Genetic Engineering and Biotechnology Institute for Postgraduate Studies University of Baghdad By Mohammed Yassin Mohammed BSc Chemistry /College of Science / Mustansiriya University (2000) Higher Diploma in Genetic Engineering and Biotechnology/ Institute of Genetic Engineering and Biotechnology For Post Graduated Studies / Baghdad University (2013) Supervised by Prof Dr Zahra M Al-Khafaji 2016 AD 1437 AH